Prof.Dr.Luis Carlos Figueira de Carvalho

 PRATICA: PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

Objetivo: Familiarizar o aluno com o preparo dos meios de cultura mais usados em microbiologia; Discutir a aplicação de meios específicos para o cultivo de microrganismos distintos

 Princípio: Os microrganismos, para um crescimento adequado, necessitam de nutrientes (fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fosfato, etc., ) e condições ambientais favoráveis (pH, pressão osmótica, temperatura, umidade, etc., ).

            Meios de cultura são associação qualitativa e quantitativa de substâncias que permitem o cultivo de microrganismos fora do meio natural. Em condições naturais, nos diversos “habitats”, os microrganismos ocorrem em populações mistas. Os meios de cultura permitem isolar os microrganismos para estudo e pesquisa.

 Material: Peptona, extrato de carne, ágar-agar,  ágar Mueller-Hinton, Caldo BHI, sangue de carneiro desfibrinado, tubos contendo 10ml de ágar-base estéril PH-metron, placas de Petri estéreis, pipetas de 1ml estéril, balança, provetas.

Equipamentos: Autoclave, cronômetro, Banho-Maria a 55ºC

Método - Formulações

Caldo Simples

  Ágar Simples

Ágar Sangue: Adicionar sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e resfriado a 55ºC, na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar nutriente adicionar 0,5ml do sangue. Homogeneizar e distribuir em placas.

Ágar Chocolate: Adicionar sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e resfriado a 70ºC, na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar nutriente adicionar 0,5ml do sangue. Homogeneizar e distribuir em placas.

Ágar Mueller Hinton

Caldo BHI (Brain Heart Infusion)

Meio P/ Teste de Motilidade

MEIOS DE CULTURA - MEIOS SÓLIDOS

1. GELOSE SIMPLES (COLUMBIA): Isolamento de bactérias comuns. Contém uma mistura de peptonas particularmente adaptada à cultura dos microrganismos mais freqüentes em amostras humanas. Pode tornar-se enriquecida pela adição de sangue (de carneiro ou de cavalo) permitindo o crescimento de bactérias mais exigentes. Pode tornar-se selectiva pela adição de misturas antibióticas.
2. GELOSE SANGUE: Isolamento de bactérias mais exigentes; É uma gelose simples adicionada com sangue de carneiro ou cavalo.Permite o crescimento de bactérias mais exigentes e permite a leitura da hemólise.
3. GELOSE CHOCOLATE: Isolamento de Haemophilus e Neisseria.É uma gelose-sangue aquecida para provocar a hemólise dos glóbulos vermelhos que assim libertam factores intracelulares fundamentais para o crescimento das bactérias do género Haemophilus - como por exemplo o factor V (NAD). Chama-se chocolate porque a placa fica com uma cor acastanhada igual à do chocolate.
4. GELOSE CHOCOLATE-HAEMOPHILUS: Isolamento selectivo de Haemophilus. É um meio selectivo para isolamento de bactérias do género Haemophilus.O isolamento de  Haemophilus a partir de produtos patológicos provenientes das vias respiratórias ou das genitais, é frequentemente difícil devido à presença de uma flora associada importante. A gelose Chocolate-Haemophilus é composta de uma base nutritiva enriquecida de factores X (hemina) e V (NAD) produzidos pela hemoglobina e pelo PolyViteX. A selectividade é obtida pela associação de antibióticos (Bacitracina e Vancomicina inibem a maioria das bactérias Gram+) e antifúngicos (Anfotericina B inibe leveduras).
5. GELOSE CHOCOLATE POLYVITEX VCAT: Isolamento selectivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis. A gelose Chocolate PolyViteX VCAT descrita por Thayer e Martin é um meio selectivo para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis a partir de amostras polimicrobianas. É composta por uma base nutritiva enriquecida em factores X (hemina) e V (NAD) produzidos pela hemoglobina e pelo PolyViteX. A selectividade é obtida pela associação de antibióticos e de antifúngicos (VCAT= Vancomicina, Colistina, Anfotericina B, Trimetoprim-sulfametoxazole) que permitem inibir a maior parte das bactérias e das leveduras existentes nas amostras.
6. GELOSE TRIPCASE SOJA: Isolamento de microrganismos não exigentes. Meio de isolamento que se destina aos microrganismos que não apresentam exigências específicas para o seu desenvolvimento. Pode ser utilizada sozinha ou adicionada com sangue (neste caso permitindo o crescimento de bactérias mais exigentes e a leitura da hemólise)
7. GELOSE MAC CONKEY: Isolamento selectivo e diferenciação de Enterobactereaceae. A gelose de Mac Conkey contém lactose e permite evidenciar a fermentação da lactose pela viragem do vermelho neutro (indicador de pH). Os microrganismos que fermentam a lactose originam colónias rosas ou vermelhas. Os microrganismos que não fermentam a lactose originam colónias incolores ou ligeiramente bege. A selectividade é proporcionada pelos sais biliares e cristal de violeta que impedem o crescimento das bactérias Gram+ (excepto Enterococcus).
8. GELOSE SS:  Isolamento selectivo e diferenciação de Salmonella e Shigella. É um meio de isolamento selectivo e de diferenciação destinado à pesquisa de Salmonella e Shigella a partir de amostras de fezes. Permite evidenciar colónias que fermentam a lactose e que reduzem o tiosulfato por produção de H2S. Os microrganismos que fermentam a lactose originam colónias rosas, os que não fermentam originam colónias incolores. Os microrganismos que produzem H2S reduzem o tiosulfato e originam colónias com centro negro. A presença de colónias incolores ou fracamente coloridas com ou sem centro negro representa uma forte prsunção de Salmonella ou Shigella. A inibição dos microrganismos Gram+ é obtida pelos sais biliares e corantes.
9. GELOSE CLED:  Isolamento de microrganismos presentes na urina. O CLED (Cistina, Lactose, Electrólito-deficiente) é recomendado para o isolamento de microrganismos causadores de infecção urinária. Também permite diferenciar os lacto-fermentadores dos que o não são. Os microrganismos lactose-fermentadores originam colónias amarelas ou amarelo-esverdeadas por acidificação do meio. Os que não fermentam originam colónias verdes, azuis ou incolores. A baixa concentração de electrólitos impede o swarming do Proteus.
10. GELOSE YERSINIA (CIN): Isolamento selectivo de Yersinia. Meio contendo manitol e Vermelho neutro(indicador de pH) permitindo a diferenciação das bactérias do género Yersinia pela coloração das colónias (rosa escuro a vermelho). A presença de colato, desoxicolato, cristal violeta, Irgasan e antibióticos inibe o crescimento das bactérias Gram+ e da maioria das Gram - CIN=Cefsulodina, Irgasan, Novobiocina
11. MEIO DE KLIGLER: Diferenciação de Enterobacteriáceas. Permite detectar a fermentação da glucose e da lactose, a produção de sulfato de hidrogéhio (H2S) e de gás. Este meio é utilizado em tubos com a gelose inclinada. A leitura é efectuada da seguinte forma: Ao nível da parte inferior: -A fermentação da glucose, presente em fraca concentração, traduz-se por uma acidificação que provoca viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo, ficando o mio amarelo (inicialmente é vermelho); A produção de gás traduz-se na presença de bolhas de ar que podem provocar a fragmentação da gelose; -A produção de H2S na presença de citrato de ferro provoca a formação de um precipitado negro na gelose. Ao nível da parte superior inclinada: -A fermentação da lactose, presente em forte concentração, provoca uma acidificação e viragem do indicador para amarelo.
12. GELOSE CAMPYLOSEL: Isolamento selectivo para Campylobacter. É um meio selectivo utilizado para o isolamento de Campylobacter a partir de amostras de fezes. É um meio básico contendo sangue. A selectividade é conferida por uma mistura de antibióticos: Cefoperazone, Vancomicina e Anfotericina B que inibem a maioria das bactérias Gram+ , Gram- e leveduras.
13. GELOSE COLUMBIA ANC + SANGUE CARNEIRO: Isolamento selectivo de bactérias Gram+  Meio rico que permite o crescimento de bactérias Gram+.  As bactérias Gram- e o género Bacillus são inibibas por uma mistura de antibióticos: ácido nalidíxico e colimicina. Permite detecção do padrão hemolítico das colónias. 
14. GELOSE CHAPMAN (MAS): Isolamento selectivo e diferenciação de estafilococos. O meio contém elevado teor em cloreto de sódio que limita o crescimento de outros microrganismos. O meio contém manitol. Os estafilococos que fermentam o manitol (como o Staphylococcus aureus) originam colónias amarelas por viragem do indicador de pH (vermelho neutro). Os que não fermentam o manitol originam colónias rosa.
15. Gelose DNASE: Identificação de Staphylococcus aureus. Meio que tem DNA incorporado. Permite identificar estirpes (Staphylococcus aureus) produtoras da enzima DNAse a qual degrada o DNA. do meio (reacção revelada por ácido clorídrico).
16. GELOSE WILKINS-CHALGREN: Isolamento de anaeróbios. Meio contendo vários suplementos nutritivos (sem sangue) que permite o crescimento dos anaeróbios importantes em patologia humana.
17. Gelose BCYE-L:  Isolamento de Legionell. BCYE-L=Buffered (tamponado), Charcoal (carvão), Yeast Extract, L-cisteína. O meio de BCYE com L-cisteina é utilizado para sementeira de amostras suspeitas de conterem Legionella. A L-cisteína é um amino-ácido indispensável para o crescimento da bactéria. O carvão activado permite adsorver os elementos tóxicos presentes no extracto de levedura. O tampão permite estabilizar o pH do meio fundamental para o crescimento da bactéria. Este meio pode ser adicionado com antibióticos e utiliza-se na sementeira de amostras com flora saprófita. A mistura antibiótica inibirá o crescimento das bactérias da flora saprófita.
18. GELOSE SABOURAUD: Isolamento de fungos. Permite o isolamento de todo o tipo de fungos (leveduras e bolores).
19. GELOSE SABOURAUD CLORANFENICOL-GENTAMICINA: Isolamento selectivo de fungos. Permite o isolamento de todo o tipo de fungos (leveduras e bolores). Utiliza-se para semear amostras contaminadas com flora bacteriana. A mistura antibiótica permite inibir a maioria dos bactérias gram+ e Gram-.
20. MEIO DE LOWENSTEIN-JENSEN (LJ): Isolamento de micobactérias Meio enriquecido com a presença de ovo, asparagina e fécula para favorecer o crescimento das micobactérias. Não contém agar. O estado sólido do meio é conseguido por coagulação das proteínas do ovo. Tem um indicador de pH: Verde de Malaquite
21. MEIO DE LOEFFLER: Isolamento de Corynebacterium Meio contendo soro coagulado que estimula o rápido crescimento das bactérias do gênero. Corynebacterium, particularmente o Corynebacterium diphtheriae desenvolvendo este as granulações metacromáticas características. As outras bactérias têm geralmente um crescimento mais lento.
22. MEIO DE TRIPTOSE: Isolamento de Brucella. Meio não selectivo composto por mistura contendo elevada quantidade de proteínas digeridas pela tripsina.
23. MEIO TESTE HAEMOPHILUS (HTM): Estudo da sensibilidade aos antimicrobianos para estirpes de Haemophilus. Meio contendo suplementos de crescimento mas com baixa concentração de antagonistas dos antimicrobianos (normalmente presentes nos meios). Permite uma leitura dos halos de inibição sem grandes interferências mesmo para o Trimetoprim-sulfametoxazole.
24. GELOSE MUELLER HINTON (MH): Estudo da sensibilidade aos antibióticos. Destina-se à realização do antibiograma por técnica de difusão. Permite o crescimento das bactérias não exigentes garantindo um mínimo de interferência dos componentes do meio no resultado do antibiograma. A sua concentração em iões bivalentes é ajustada para assegurar uma precisão mais correcta na determinação da sensibilidade das Pseudomonas aos aminoglicosídeos e às tetraciclinas. O seu baixo teor em timina-timidina (elementos inibidores da actividade das sulfamidas) diminui os fenómenos de crescimento à volta dos discos e permite uma determinação precisa dos diâmetros de inibição.
25. PORTAGERM: Meio de transporte – mantém viabilidade de aeróbios e anaeróbios Meio sólido para transporte de amostras. O agar do meio inibe a difusão de oxigénio presente quando se insere a amostra. Agentes redutores presentes no meio combinam-se com o oxigénio livre mantendo assim a atmosfera de anaerobiose. Tem um indicador (resazurina) que indica a presença ou ausência de oxigénio: Meio de cor azul = presença de oxigénio (bactérias anaeróbias já inviáveis). Meio incolor = ausência de oxigénio.
26. MEIO DE AMIES COM CARVÃO: Meio de transporte.Meio tamponado e com carvão que permite a sobrevivência de bactérias fastidiosas como a Neisseria gonorrhoeae . Utilizado no transporte de amostras para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae (exsudados vaginais, orofaríngeos, rectais).
27. MEIO DE CARY-BLAIR: Meio de transporte. Meio destinado a aumentar a sobrevivência das bactérias entéricas utilizado no transporte de amostras fecais (fezes, zaragatoas rectais) para pesquisa de bactérias patogénicas entéricas (particularmente importante na sobrevivência de Campylobacter). Contém um baixo conteúdo nutritivo que permite a sobrevivência das bactérias sem multiplicação; tioglicolato que mantém um baixo potencial de oxidação-redução; e um elevado pH que minimiza a destruição das bactérias quando se produz ácido pelo metabolismo normal das bactérias.

MEIOS DE CULTURA - MEIOS LÍQUIDOS

1. MEIO DE TODD-HEWITT: Enriquecimento de Streptococcus Caldo glicosado e tamponado que permite o crescimento abundante de bactérias do gênero Streptococcus. Pode ser enriquecido com sangue.
2. MEIO DE TIOGLICOLATO: Enriquecimento de aeróbios, anaeróbios e microaerófilos. É um caldo de enriquecimento onde se desenvolvem as bactérias aeróbias, anaeróbias e microaerófilas. É utilizado para semear amostras biológicas cujos microrganismos possam estar presentes em baixas concentraões. É supérfluo incubar os tubos em anaerobiose. Também se utiliza para controlo de esterilidade.
3. MEIO DE CARNE: Enriquecimento de aeróbios e anaeróbios. Caldo peptonado contendo carne de coração cozida. Permite o crescimento de aeróbios e anaeróbios.
4. MEIO DE SELENITO (MEIO DE LEIFSON): Caldo de enriquecimento de Salmonell. Caldo contendo selenito de sódio destinando-se ao enriquecimento de Salmonella a partir das fezes. A sua composição favorece o crescimento da Salmonella no meio de uma flora polimicrobiana.
5. MEIO DE TETRATIONATO (MEIO DE MULLER-KAUFFMANN): Caldo de enriquecimento de Salmonella Caldo contendo tetrationato, bílis e verde brilhante que inibem o crescimento da maioria das bactérias entéricas. Destina-se ao enriquecimento de Salmonella a partir das fezes. A sua composição favorece o crescimento da Salmonella no meio de uma flora polimicrobiana.
6. ÁGUA DE PEPTONA ALCALINA: Enriquecimento de Vibrio cholerae. Utiliza-se na sementeira de fezes quando se suspeita de cólera. É um caldo composto por água  eptonada contendo 10% cloreto de sódio e com pH hiperalcalino (8.8). Permite o crescimento de vibrios (e também plesiomonas e aeromonas) inibindo o seu pH a maioria das outras actérias entéricas.
7. MEIO DE UREIA-INDOL: Detecção dos caracteres Urease, Indol e TODA. Este meio permite detectar nas enterobactérias a presença de urease, de triptofano-desaminase (TODA) e a produção de indol. As bactérias que produzem urease degradam a ureia do meio, alcalinizando-o o que provoca a viragem do indicador de pH (vermelho de fenol) a vermelho violeta. O meio contém L-triptofano: a sua degradação pelas bactérias que possuem uma triptofanase é seguida de uma produção de indol, revelada pelo reagente de Kovacs: em caso de reacção indol positiva, um anel vermelho aparece à superfície do meio; a sua degradação pelas bactérias que possuem uma triptofano-desaminase é seguida da produção de ácido indol-pirúvico revelada por uma solução de percloreto de ferro que dá cor castanha ao meio.

COMENTÁRIOS

           Desde o inicio, os microbiologistas aprenderam que podiam cultivar uma grande variedade de bactérias em “caldos”, obtidos pela cocção de tecidos animais ou vegetais. Em 1923, Mueller[1], tentando definir esta vaga necessidade, em termos de compostos específicos, descobriu o então desconhecido aminoácido, metionina. A nutrição bacteriana tornou-se campo dinâmico durante os anos subsequentes; porém com o reconhecimento da unidade bioquímica, os vários esquemas nutritivos revelaram ser simplesmente pequenas variações de um tema central e o estudo da nutrição bacteriana perdeu muito de seu interesse teórico. Apesar disso, este campo detém sua importância prática e ainda apresenta desafios; por exemplos, o bacilo da lepra, o treponema da sífilis e riquétsias não podem ser cultivados em meios artificiais.

            Inicialmente, o único método existente para contagem de bactérias ou para o isolamento de culturas puras (clones), era a diluição até a extinção, isto é, até a perda da infectividade. Um progresso importante foi a introdução dos meios sólidos por Koch. Os materiais usados inicialmente eram pouco satisfatórios: a superfície da batata cortada podia permitir um crescimento confluente, enquanto que a gelatina permanecia sólida apenas em temperaturas relativamente baixas, sendo liquefeita por muitos microrganismos. Assim sendo, Frau Hesse, esposa de um médico e bacteriologista amador alemão, introduziu o ágar, um produto japonês que ela empregava  para engrossar as sopas.

            O ágar (do malaio “agar-ágar”) é um polissacarídeo obtido de certas algas marinhas (várias algas vermelhas). Constitui-se primariamente de galactose, com um radical sulfato para cada 10 ou 50 resíduos. O ágar mostrou-se ideal para formar meios sólidos. Não é tóxico para a bactéria, e muito poucas conseguem atacá-lo. Em concentrações de 1,5 a 2,0% apresentam uma superfície úmida para permitir crescimento, mas seca o bastante para manter separadas as colônias (Excepcionalmente, certos microrganismos móveis, como Proteus, exigem ágar a 5% para impedir a formação do véu.

            Após a fusão entre 80 e 100ºC, as soluções de ágar permanecem líquidas até 45-50ºC, temperatura que muitas bactérias toleram por alguns instantes; após a solidificação em temperatura ambiente, permanecem sólidas até muito acima de 37ºC. A estrutura fibrosa de um gel é suficientemente compacta para impedir a movimentação de bactérias no seu interior, mas bastante aberta para permitir a difusão, até mesmo de nutrientes macromoleculares.

QUESTÕES

1. As condições necessárias para preparar os meios de cultura foram observadas? Qual a influencia dessas condições para a conclusão dos trabalhos?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. O que são macronutrientes ? Cite os principais exemplos
5. Os meios de cultivo e a idade da colônia exercem alguma influência na morfologia de células em coloração simples?
6. Alguns microrganismos, como Micobacterium leprae, ainda não se conseguiu cultivar em meios de cultura. Quais as possíveis dificuldades e qual a importância desta técnica?
7. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
8. Descreva os procedimentos para realização do teste de esterilidade dos meios de cultura
9. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
10. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

[1] J.Bacteriol., 7:309 (1922)