Prof.Dr.Luis Carlos Figueira de Carvalho

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Reação antígeno x anticorpo

Reação antígeno x anticorpo

Reação Ag x Ac 

TÍTULO: FATORES INTERFERENTES NA REAÇÃO ANTIGENO – ANTICORPO

 

OBJETIVO: Demonstrar os fatores interferentes na reação antígeno-anticorpo

 

PRINCÍPIOS: Reação de aglutinação das hemácias por anticorpos contra antígenos de superfície do grupo sangüíneo ABO e fator RH, realizadas em diferentes condições físico-quimica, onde se observa a influencia da temperatura, do pH, da concentração dos anticorpos e da força iônica.

 

MATERIAL:

  • 1 Seringa descartáveis de 3ml com agulha, garrote, algodão e álcool 70%
  • Tubos de ensaio pequeno ( tubo de hemólise) e galeria para esses tubos
  • 1 Pipetas automáticas de 500uL  com ponteiras
  • 1 Pipetas automáticas de 100uL  com ponteiras
  • Pipetas graduadas 1/10 de 5ml com pêra
  • 500ml de Soro fisiológico,
  • 10 ml Solução de NaCl a 5% e
  • 10ml de solução tampão pH 5,0
  • Placas de microtitulação

 

PROCEDIMENTOS

  1. Coletar de 1 a 2 ml de sangue venoso e separar 500uL em tubo de hemólise para proceder a lavagem de hemácias da seguinte forma:
    1. No tubo com 500uL de sangue adicionar 4,5 ml de soro fisiológico,
    2. Homogeneizar e centrifugar a 1500 rpm/3min.
    3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento (hemácia) em 5ml de soro fisiológico,
    4. Homogeneizar e centrifugar a 1500 rpm/3min.
    5. Repetir mais uma vez a operação, ressuspender o sedimento em 2,5 ml de soro fisiológico. 
  1. Realizar a tipagem sanguínea da seguinte forma:
    1. Enumerar 3 tubos de ensaio ( A, B e D )
    2. Em cada tubo, colocar 1 gota da suspensão de hemácia
    3. Colocar 1 gota do soro anti-A, anti B e anti-D, nos respectivos tubos
    4. Incubar no banho-maria a 37ºC por 5min.
    5. Observar aglutinação nos tubos agitando suavemente os tubos
  1. Influência a temperatura na reação antígeno – anticorpo
    1. Enumerar dois tubos e colocar 1 gota de suspensão de hemácia e uma gota do anti-soro correspondente ( anti-A ou anti-B ) e incubar 1 tubo a 5ºC (geladeira) e outro a temperatura ambiente ( 22 ºC) por 5min.
    2. Averiguar aglutinação e comparar com o aglutinante da etapa 2 (37 ºC)
  1. Influência do título do anticorpo, do pH e da força iônica
    1. Em uma placa de microtitulação 100 uL de soro fisiológico nos 6 poços da primeira linha ( A); 100 uL de sol. NaCl a 5% nos 6 poços da segunda linha ( B) e 100 uL de tampão fosfato pH 5,0 nos 6 poços da terceira linha;
    2. Colocar 100ul do soro anti-A ou anti-B no primeiro poço de cada linha, homogeneizar e transferir para o segundo e assim, sucessivamente até o 6 poço, obtendo assim, diluição do soro 1:2 (poço 1)  – 1:4 (poço 2) – 1:8 (poço 3)  – 1:16 (poço 4) – 1:32 (poço 5) – 1:64 (poço 6). Repetir a operação nas linhas B e C
    3. Em todos os poços, adicionar 100 uL de suspensão de hemácia a 5%, homogeneizar suavemente a incubar a 37 ºC por 30 minutos.
    4. Anotar os resultados

QUESTÕES

  1. Classifique os tipos de reações antígeno-anticorpo e assinale aquela demonstrada nos experimentos;
  2. Analise a influência da temperatura, da concentração do anticorpo; do pH e da força iônica nas reações antígeno – anticorpo
  3. Além dos fatores pesquisados que outros poderão interferir na reação antígeno-anticorpo?
  4. De que forma pode-se aplicar essas informações na prática de análises clinicas
  5. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
  6. Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
  7. Faça comentários e ou sugestões para realização da tipagem sanguínea na rotina de análises clínicas

Faça a fundamentação teórica sobre reação antígeno – anticorpo, aplicação e fatores interferentes

 

 

 

REAÇÕES ANTÍGENO - ANTICORPO

 Reação “in vitro” ou  “in vivo” (no plasma, líquor, intimidade dos tecidos e pele) que revela a presença do antígeno ou do anticorpo

IMPORTÂNCIA:

  • Diagnóstico imunológico
  • Evolução e tratamento ( critério e cura e recaída)
  • Prognóstico ( cura sorológica)
  • Inquéritos epidemiológicos
  • Análise de antígenos e de anticorpos

TÍTULO DE UM SORO: Teor em anticorpos. Amboceptor

REPETIÇÃO DAS PROVAS:Ex.  Viroses e Riquétsioses, com intervalo de 14 dias. Verificar elevação 4 vezes do título original.

INTERPRETAÇÃO CUIDADOSA COM OS DADOS CLÍNICOS:  “Reações cruzadas” podem ocorrer ( antígenos comuns ).

PROVAS INTRADÉRMICAS: Persistem positivas e as sorológicas se negativam com o tempo. A chamada “cicatriz sorológica” pode ocorrer.

TIPOS DE REAÇÕES

I - REAÇÃO DE  AGLUTINAÇÃO (FLOCULAÇÃO CELULAR )

  • Reação de Widal - Febre tifóide e paratifóide . Antígenos O, H, e Vi.

Salmonella typhi

Salmonella paratyphi A

Salmonella paratyphi B

  • Reação de Weil-Felix: Riquetsioses, exceção da febre Q.

                                           Proteus OX2, OXK, OX1

  • Reação de Paul-Bunnel-Davidsohn: Mononucleose

hemácia de carneiro - 1ª fase

Rim de cobaio/ hemácias de boi - 2ª fase

(Absorção de aglutinina)

  • Mono-teste para mononucleose: hemácias formalizadas de cavalo
  • Reação de Huddleson: Brucelose ( Brucella abortus )
  • Reação de Rubino: Mycobacterium leprae ( hemácia de carneiro formalizada)
  • Tipagem de bactérias: soros mono e polivalentes
  • Doença de Weil - Leptospira ictero-haemorrhagiae

II -  REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO E DE PRECIPITAÇÃO

            O antígeno figurado ou em micelas é “sensibilizado” com polissacarídeos, ácido tânico, benzidina bisdiazotada, difluordinitrobenzeno, enzimas ou outras substâncias. Ex. Chagas, Esquistossomose, teste de látex p/ diagnóstico da gravidez.

IMUNOPRECIPITAÇÃO EM GEL

            A imunoprecipitação em gel nada é mais do que uma interação de Ag e Ac no interior de um suporte neutro, constituído por ágar ou ágarose. Esta técnica combina difusão com precipitação. A difusão dos componentes da reação pode ser unidirecional ou radical, passiva ou impulsionada por um campo elétrico. Os componentes da reação são colocados em regiões opostas, dentro de orifícios previamente preparados, em placa ou lâmina de ágarose, de forma que eles possam se difundir livremente um em direção ao outro, formando linha de precipitação, facilmente visível, quando atingem uma relação ótima de Ag Ac (ponto de equivalência ).

IMUNODIFUSÃO RADICAL DUPLA

A imunodifusão radical dupla ou de Ouchterlony é uma técnica de imunoprecipitação em gel, onde os componentes da reação se difundem radical e passivamente, formando linhas de precipitação no ponto de equilíbrio Ag X Ac.

 III - REAÇÕES DE FLOCULAÇÃO MICELAR

            Precipitação em tubos, placas, gel-de-ágar ou gel-de-amido.

  • Reação de Muniz & Freitas: Doença de Chagas
  • Reação de Fava Netto: Blastomicose sul americana
  • Reação de Ouchterlony : Dupla difusão em gel-de-ágar
  • Imuno-eletroforese (Grabar & Williams)
  • Prova de Ascoli : Carbúnculo
  • Reação de VDRL: Treponematose
  • Sistemática bacteriana
  • Reação de Uhlenhuth: Medicina legal e higiene

 IV - REAÇÕES DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

Antígeno deve possuir bom poder fixador e não impediente

Soro inativado ( 56ºC - 30 min.)

Complemento (C’) ou alexina - 1ª fase

(O complexo Ag-Ac  liga com o complemento)

Hemolisina

Hemácia de carneiro - 2ª fase

Ausência de hemólise - Reação positiva

Presença de hemólise - Reação negativa

 

V - REAÇÃO DE NEUTRALIZAÇÃO

            Aplicada principalmente para diagnóstico de viroses. O antígeno é neutralizado pelo anticorpo, perdendo seu poder infectante para ovos, para cultura de tecidos e para animais de laboratório.

  • Diagnóstico da Poliomielite
  • Diagnóstico da febre amarela

 VI -  REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

            A imunofluorescência tem sido utilizada com sucesso para investigação de numerosos problemas imunológicos ( destino do antígeno infectado, localização e titulação de anticorpos) e virológicos ( localização dos vírus).

  • Diagnóstico bacteriológico das diarréias infantis por Escherichia coli patogênicas,
  • Diagnóstico da coqueluche,
  • Diagnóstico das meningites por H. influenzae,
  • Caracterização dos estreptococos do grupo A,
  • Pesquisa do corpúsculo de Negri,
  • Demonstração do vírus da pneumonia atípica primária, etc.

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA: É o método pelo qual se pode detectar antígenos figurados através de soro hiperimunes específicos, conjugados  com o isotiocianato de fluoresceína.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA: Baseia-se no fato dos anticorpos serem imunoglobulinas. Um soro anti-globulina ( soro de Coombs ) reage com as globulinas de uma mesma espécie animal. Se um soro anti-globulina humana for marcada com fluoresceína, obtêm-se conjugado útil para evidenciação dos anticorpos em soros humanos.

VII - IMUNOELETROFORESE

            A imunoeletroforese é uma técnica que combina difusão passiva com ativa. Neste tipo de reação a interação antégono versus anticorpos (Ag X Ac) ocorre quando o Antígeno é colocado em um orifício no centro da lâmina e submetido a uma corrente elétrica. Após o fracionamento do Antígeno de encontro ao  Anticorpo, formando linhas de precipitação no ponto de equivalência.

CONTRAIMUNOELETROFORESE (CIE)

 A contraimunoeletroforese é uma técnica que consiste em submeter Ag e Ac a uma corrente elétrica

SEPARAÇÃO ELETROFORÉTICA DE PROTEÍNAS ( SDS - PAGE)

           A técnica eletroforese SDS - PAGE é utilizada para verificar se uma proteína está pura ou se tem subunidades. As subunidades das proteínas podem ser separadas e seus pesos moleculares determinados por eletroforese em gel uni-dimensional na presença de detergentes como o dodecil sulfato de sódio (SDS) ou “spots” em gel bi-dimensional.

            A eletroforese pode ser usada também para recuperar e isolar grandes quantidades de proteínas através de eletroeluição.

            Após a solubilização das proteínas pelo aquecimento na presença de SDS e 2 mercaptoetanol ( agente químico que reduz pontes de enxôfre) uma alíquota da solução de proteínas é aplicada a um gel e as proteínas individuais ou suas subunidades são separadas eletroforeticamente. 

WESTERN  BLOTTING

Uma mistura antigênica deve ser solubilizada, geralmente com dodecil sulfato de sódio ( SDS), uréia, e/ou agentes redutores tais como 2 - mercaptoetanol. Após a solubilização, o material é separado pela eletroforese em gel de poliacrilamida(SDS-PAGE).Os antígenos são então transferidos eletroforeticamente para um filtro de nitrocelulose, ficando ligados irreversivelmente. O filtro é então bloqueado para prevenir ligação não específica de anticorpos e colocado para reagir com o anticorpo de interesse. O anticorpo é dectado por um conjugado anti-imunoglobulinas (Ig) marcado com peroxídase e visualizado incubando o papel de filtro na presença de um substrato precipitável. O anticorpo também pode ser detectado através da proteína A marcada com I125.

 VIII - REAÇÕES DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO

Gripe, sarampo, caxumba ( Mixovírus ) 

IX - TÉCNICA IMUNOENZIMATICAS - ELISA

       (ENZYME-LIKE IMMUNOSORBENTE ASSAY)

            Antígenos e anticorpos podem ser detectados e quantificados utilizando-se o ensaio imunoenzimático tipo ELISA.

  • ELISA para detecção e quantificação de anticorpos
  • ELISA tipo sanduiche

            O teste de ELISA clássico pode ser usado para quantificação de anticorpos . Para a reação necessita-se de uma fase sólida (placas de poliestireno) onde o antígeno é adsorvido. A amostra contendo o anticorpo a dosar é incubada com o antígeno insolubilizado. Após lavagens para retirada de anticorpos que não reconheceram o antígeno, adiciona-se um “conjugado” (anti-imunoglobulina-Enzima), que se ligará aos sítios livres do anticorpo.

            Por este modelo, a qualidade do conjugado ligado à fase sólida é proporcional à quantidade  de anticorpos ligados ao antígeno adsorvido no plástico. Finalmente, a atividade enzimática é revelada por um substrato - ELISA, possibilitando em investigações mais elaboradas, o uso  de conjugados classe específica para determinar anticorpos das classes IgM, IgA e IgE.

 

CONJUGAÇÃO DE ENZIMAS A ANTICORPOS

       Há vários métodos para ligar covalentemente haptenos, proteínas e carboidratos a proteínas. No momento, conjugados enzima-proteína são preparados principalmente usando periodato de sódio ou glutaraldeído. A ligação é estável, não se alterando o sítio antigênico do anticorpo, nem o sítio ativo da enzima.

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