NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE Vibrio parahaemolyticus
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a determinação do número mais provável de Vibrio parahaemolyticus.
Aplica-se a amostras de pescado e derivados.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Provas presuntivas
2.1.1 Enriquecimento em caldo seletivo Inoculação em meio de cultura de enriquecimento seletivo: caldo glicose sal Teepol (GSTB) ou caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB), em que a presença de Vibrio parahaemolyticus é evidenciada pela turvação do meio após a incubação.
Em sua composição, o meio GSTB apresenta teepol, solução aquosa de sulfatos de sódio alcalinos primários que atuam na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento e formalina que funciona como um agente antimicrobiano.
Como o Vibrio parahaemolyticus é halófilo obrigatório, os dois meios contém 3% de cloreto de sódio.
2.1.2 Isolamento em ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS)
Isolamento se realiza em ágar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contém elevada concentração de tiossulfato e citrato de sódio, responsáveis pela inibição do crescimento das enterobactérias presentes.
A bile e o colato de sódio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para amarelo quando da formação de ácido pelos microrganismos que fermentam a sacarose contida no meio.
2.2 Provas de identificação: A identificação de Vibrio parahaemolyticus é feita por meio de provas bioquímicas, sorológicas, morfológicas e tintoriais.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar Müeller-Hinton sal 3%;
Ágar nutriente sal 3%;
Ágar gelatina sal 3%;
Ágar soja triptona sal 3%;
Ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS);
Ágar ferro três açúcares (TSI) sal 3% ou Ágar Kligler sal 3%;
Ágar motilidade sal 3%;
Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB);
Caldo peptonado sem sal;
Caldo peptonado sal 3%;
Caldo peptonado sal 6%;
Caldo peptonado sal 8%;
Caldo peptonado sal 10%;
Caldo ONPG sal 3%;
Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%;
Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%;
Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%;
Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%;
Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%;
Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%;
Solução salina peptonada 0,1% sal 3%;
Solução fisiológica (NaCl 0,85%);
Agente vibriostático O 129 10µg ;
Agente vibriostático O 129 150 µg;
Arabinose;
L-arginina;
L-lisina;
Manitol;
Sacarose;
Óleo mineral ou parafina líquida estéreis;
Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina);
Teepol;
O-nitrofenil-â-D-galactopiranosídeo ou p-nitrofenil-â-D-galactosídeo;
Etanol 96%;
Reagentes para coloração de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo e Pesagem: Preparar a amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.
Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Esta é a diluição 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Provas presuntivas
5.3.1 Inoculação em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluição inicial (10-1), efetuar as demais diluições desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mínimo mais duas diluições) de acordo com as instruções contidas no Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluições desejadas em séries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB.
5.3.2 Incubação: Incubar os tubos a 36 ± 1°C por 18 horas a 24 horas.
5.3.3 Leitura: A presença de turvação do meio indica a suspeita da presença de Vibrio parahaemolyticus.
Anotar o número de tubos de cada série que apresentaram turvação.
5.3.4 Isolamento em ágar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS)
5.3.4.1 Inoculação: A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvação, sem agitá-lo e com auxílio de uma alça de níquel-cromo, de platina ou descartável estéril, retirar uma alçada do crescimento da superfície e estriá-la sobre a superfície seca de ágar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS).
5.3.4.2 Incubação: Incubar as placas em posição invertida a 36 ± 1ºC por 24 horas.
5.3.4.3 Leitura: Verificar o aparecimento de colônias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada, com 2 a 3 mm de diâmetro, típicas de Vibrio parahaemolyticus.
Quando não houver colônias suspeitas, o resultado será negativo para o tubo de origem.
5.4 Provas preliminares para identificação de Vibrio parahaemolyticus
De cada placa, selecionar de 2 a 3 colônias típicas e transferí-las simultaneamente para tubos contendo caldo peptonado sal 3% e ágar nutriente sal 3% inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
5.4.1 Coloração de Gram: A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, proceder à coloração de Gram de acordo com as instruções descritas no Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste manual.
O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos.
5.4.2 Crescimento com 8% de sal e sem sal: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, uma alçada para um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%.
Incubar os tubos a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
Após o período de incubação, verificar a presença de turvação indicativa da ocorrência de crescimento.
O Vibrio parahaemolyticus não cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8% de sal.
5.4.3 Prova da oxidase: A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plástico descartáveis, pipetas Pasteur, ou alça de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponíveis.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após este tempo, podem ocorrer reações falso-positivas.
O aparecimento de cor azul (quando é usado o reativo N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado é o oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva.
OBS: Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva.
O Vibrio parahaemolyticus é oxidase positiva
5.4.4 Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxílio de alça de níquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%.
Cobrir o meio com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéreis.
Incubar a 36 ± 1°C por 18 a 24 horas.
Após o período de incubação, observar a mudança de coloração do meio, de vermelho para amarelo, devido à fermentação da sacarose e produção de ácido.
O Vibrio parahaemolyticus não altera a coloração do meio pois não é capaz de fermentar a sacarose.
5.4.5. Ágar ferro três açúcares sal 3% (TSI) ou Ágar Kliglerferro sal 3%
A partir do cultivo mantido no ágar nutriente sal 3% inclinado, com auxílio de agulha de platina ou níquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do ágar e estriando a superfície inclinada, tubos com ágar TSI sal 3% ou ágar Kligler ferro sal 3%. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.
O Vibrio parahaemolyticus apresenta base ácida (amarela), sem gás, sem produção de H2S e bisel alcalino (vermelho).
5.4.6 Teste ONPG: A partir da cultura em TSI, inocular uma alçada espessa em tubo contendo 0,5 mL de caldo ONPG sal 3%.
Incubar em banho-maria a 36 ± 1ºC, durante 2 horas. Examinar os tubos , verificando o aparecimento ou não de cor amarela, indicativa de reação positiva. Se o caldo permanecer incolor, a reação é negativa.
O Vibrio parahaemolyticus é ONPG negativo.
5.5 Provas adicionais para identificação de Vibrio parahaemolyticus
As colônias que apresentarem comportamento compatível com V.parahaemolyticus nas provas preliminares, deverão ser submetidas às provas adicionais, conforme descrito em 5.5.1 a 5.5.9.
5.5.1 Teste do crescimento a 42ºC: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo peptonado sal 3%.
Incubar a 42 ± 1ºC por 24 horas.
Após o período de incubação, observar a presença de turvação dos meios.
O víbrio parahaemolyticus cresce à temperatura de 42ºC.
5.5.2 Ágar gelatina sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular uma placa de Petri contendo ágar gelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em até 6 setores e cada cultivo pode ser inoculado no centro de cada setor).
Incubar as placas a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
Colocar as placas em refrigeração por alguns minutos antes e realizar a leitura, o que facilita a vizualização do halo.
O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presença da gelatinase.
O Vibrio parahaemolyticus é gelatinase positiva.
5.5.3 Teste da motilidade: A partir da cultura mantida no ágar nutriente sal 3% inclinado, com auxílio de agulha de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, através de picada central, inocular um tubo contendo ágar motilidade sal 3%.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.
Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva.
O Vibrio parahaemolyticus apresenta motilidade positiva.
5.5.4 Prova de Hugh-Leifson glicose (OF): A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3% , inocular, com auxílio de agulha de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, dois tubos contendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%.
Cobrir um dos tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
Após o período de incubação, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presença de bolhas de gás nos meios.
A cor amarela nos dois tubos significa fermentação da glicose.
A presença de cor amarela somente no tubo sem óleo mineral significa utilização oxidativa da glicose.
O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produção de gás, ou seja, os dois tubos devem apresentar coloração amarela.
5.5.5 Descarboxilação da lisina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%.
Inocular também um tubo contendo meio base (sem adição do aminoácido) que servirá de controle.
Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril.
Incubar a 36 ± 1ºC por, no máximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol lisina sal 3% não inoculado, que servirá de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias.
Durante o período de incubação, a cor do meio passa para amarela devido à fermentação da glicose, e, ocorrendo a descarboxilação da lisina, o meio retorna à cor púrpura devido à produção de aminas primárias e dióxido de carbono.
O tubo controle, sem aminoácido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina.
5.5.6 Hidrólise da arginina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo arginina sal 3%.
Inocular também um tubo contendo o meio base (sem adição do aminoácido) que servirá de controle.
Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril.
Incubar a 36 ± 1ºC por, no máximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% não inoculado, que servirá de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias.
Durante o período de incubação, a cor do meio passa para amarela devido à fermentação da glicose, e, ocorrendo a hidrólise da arginina, o meio retorna a cor púrpura devido à produção de aminas primárias e dióxido de carbono.
O tubo controle, sem aminoácido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
O Vibrio parahaemolyticus não hidrolisa a arginina.
5.5.7 Prova da fermentação do manitol e arabinose: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%.
Cobrir o meio com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.
Após o período de incubação, observar a mudança de coloração dos meios de vermelho para amarelo, devido à fermentação dos açúcares e conseqüente produção de ácido.
99% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta o manitol.
50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta a arabinose.
5.5.8 Teste do halofilismo: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular tubos contendo caldo peptonado sal 6% e 10%.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.
Após o período de incubação, observar a presença de turvação nos meios.
O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e não cresce, ou apresenta crescimento discreto, a 10% de sal.
5.5.9 Sensibilidade do agente vibriostático O/129
Esta prova é utilizada como diferencial entre Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus.
Embeber um “swab” previamente esterilizado com a cultura suspeita mantida em caldo peptonado sal 3% e inocular uma placa contendo ágar Müeller-Hinton sal 3% ou agar soja triptona sal 3%, espalhando bem o inóculo, de forma a obter um crescimento o mais homogêneo possível.
Deixar as placas absorverem o inóculo.
Colocar um disco do agente vibriostático O/129 com concentração de 10µg e um disco de concentração de 150µg.
Incubar as placas a 36 ± 1ºC por 24 horas.
O Vibrio parahaemolyticus é resistente à concentração de 10µg de agente vibriostático O/129 enquanto o V. vulnificus é sensível.
Todos os víbrios são sensíveis à concentração de 150µg do agente O/129.
6. RESULTADOS
Serão consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificação:
Motilidade - positiva
Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo
Descarboxilação da lisina - positivo
Hidrólise da arginina - negativo
Crescimento a 42ºC - positivo
Fermentação do manitol - positivo
Fermentação da arabinose - positivo
Sensibilidade ao Agente Vibriostático O/129 - 10µg - resistente
Sensibilidade ao Agente Vibriostático O/129 - 150µg - sensível
Ágar gelatina sal 3% - crescimento com formação de halo
Halofilismo (6% sal) - positivo
Halofilismo (8% sal) - positivo
Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto
A partir da combinação de tubos com resultado positivo em cada série, calcular o Número Mais Provável de acordo com o Anexo III, “Procedimentos Básicos de Contagem”, deste Manual.
Expressar o valor obtido em NMP/g.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
ELLIOT, E.L.; KAYSNER, C.A.; JACKSON, L. e CEBULE, T.A. V. cholerae, V parahaemolyticus, V. vulnificus and Others víbrio spp. In Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http: www.cfsan.fda.gov.
MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3ed. Lippincott Williams & Wilkins (Ed.), Philadelphia. 2000. p. 160-169.
