Prof.Dr.Luis Carlos Figueira de Carvalho

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Imunoprecipitação em gel

Imunoprecipitação em gel

IMUNOPRECIPITAÇÃO EM GEL (SEG. OUCHTERLONY)

 Objetivos: Averiguar uma reação de precipitação; fazer a comparação direta de vários antígenos e antissoros e  estudar as reações cruzadas entre antígenos

 Princípio:  Tanto o antissoro quanto o antígeno solúvel se difundem no ágar e na zona de equilibrio das concentrações (Ag x Ac) forma um  precipitado que é visto em forma de uma linha.. A precipitação em gel de ágar é amplamente utilizada em imunologia de diagnóstico. Ela é particularmente  útil na quantificação de concentrações de imunoglobulinas e na imunoeletroforese. Na imunoquantificação, o ágar é impregnado por antissoro e o material a ser testado é colocado em orifícios. Os diâmetros dos anéis concêntricos de precipitação que se formam são diretamente proporcionais à concentração do antígeno em questão. Estas técnicas são úteis na quantificação de imunoglobulinas em muitos estudos epidemiológicos, como as doenças imunoproliferativas e as deficiências imunológicas.

 Material: Lâmina de microscópio, agarose a 1%  preparado salina (contendo mertiolato a 0,01% ou ázida sódica a 0,1%), Citrato de sódio a 5%, Corante Coomasie Blue Brilhante R a 0,15g%, Solução descorante (20ml de ácido acético glacial+40ml Etanol+40ml de água),  molde para perfurar os orifícios; pipeta Pasteur; antissoro; antígeno;

 Metodologia:

  • Recobrir uma lâmina de microscópio com agarose 0,1%(em água) e deixar secar na estufa;
  • Depositar nessa lâmina cerca de 5ml de agarose a 1%  preparado em salina (contendo mertiolato a 0,01% ou ázida sódica a 0,1%) até obter camada de 3mm de espessura;
  • Esperar solidificar e praticar, com um molde, 1 orifício (3mm de diâmetro) na região central e 3 ou mais em torno do orifício central, de modo que a distância entre os orifícios da circunferência e o central seja aproximadamente 10mm;
  • Colocar o antissoro (10mL) no orifício central e os antígenos em diferentes diluições, nos orificios periféricos. Pode-se, também, proceder de modo inverso;
  • Conservar as lâminas em câmara úmida, no refrigerador, ou a uma outra temperatura constante e observar a formação das linhas de precipitação durante 24 a 48 horas ou mais;
  • Lavar  1hora  com citrato de sódio a 5% e deixar em salina durante 24 horas, fazendo-se 3 a 4 trocas;
  • Envolver em papel de filtro umedecido em água e secar a 37ºC  “overnight”
  • Lavar com água para retirar fragmentos do papel de filtro sobre o gel
  • Corar com Coomasie Blue Brilhante R durante 5min. Descorar com solução descorante, para se obter visualização das linhas de precipitação

 Interpretação: Averiguar a formação de linhas de precipitação. De acordo com o parentesco imunológico dos antígenos empregados, quatro tipo básicos de precipitação podem formar-se nas placas de Ouchterlony: (a) Tipo I – reação de identidade; b) Tipo II – reação de não identidade; c) Tipo III – reação de identidade parcial; d) Tipo IV – reação de inibição.

 

 

 

 

Comentários:

            A reação de precipitação é uma ferramenta analítica muito útil na identificação de antígenos ou anticorpos desconhecidos. Se permitirmos que dois antígenos diferentes A e B, difundem-se em ágar, a partir de orificios adjacentes , em direção aos seus anticorpos específicos (anti-A ou anti-B) em placas diferentes serão obtidas linhas de precipitação para cada sistema antígeno-anticorpo. A reação de proporção ótima para a reação A-anti-A  pode  diferir da existente para reação  B-anti-B. Isto pode ser devido a diferenças no peso molecular ou na concentração, que podem influenciar o grau de difusão. Com esta técnica, também possível determinar se os dois antígenos são idênticos (tipo I), similares (tipo III) ou diferentes (tipo II), através da justaposição das reações entre orificios adjacentes. Por exemplo, um anti-soro que reaja com ambos antígenos é colocado em orifício central, circundado por orifícios que contenham os dois antígenos suspeitos. Permite-se que a difusão ocorra e que se formem linhas de precipitração.

Se os antígenos forem idênticos, vão difundir-se no mesmo grau, e a zona de precipitação ótima será alcançada na mesma localização. Por isso as duas linhas vão coalescer  como uma reação de identidade ( reação tipo I). Com posterior difusão do antígeno ou do anticorpo, ocorrerá a formação de complexos solúveis. Entretanto, a coalescência será mantida, já que as linhas continuam a se formar e a se dissolver no mesmo grau.

Caso os dois antígenos forem completamente diferentes,as linhas vão se cruzar na reação de não identidade. Nesse caso, a concentração de um antígeno tem pouca influência no comportamento do outro, e as duas faixas que se formam vão se cruzar uma sobre a outra.

Algumas vezes, dois antígenos podem ser similares e compartilhar um determinante comum: isto resulta na formação de um esporão – reação que indica identidade antigênica parcial, ou seja, similaridade dos antígenos.

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