Prof.Dr.Luis Carlos Figueira de Carvalho

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FUNGOS

FUNGOS

 

MORFOLOGIA DOS FUNGOS FILAMENTOSOSOS

Objetivos: Observar a morfologia das estruturas de alguns fungos; comparar morfologicamente duas espécies de fungos das classes Phycomycetes e Ascomycetes

Princípio: Os fungos são organismos eucarióticos, heterotróficos, aclorofilados, imóveis, respiração aeróbica e comumente filamentosos. Crescem em meio de cultura com pH de 2 a 9. Produz esporos de forma sexuada e assexuadamente. Os esporos sexuados e as estruturas que os envolvem, são geralmente distinguíveis morfologicamente dos esporos assexuados, os quais são formados por simples diferenciação do talo em desenvolvimento. O talo de um fungo é formado de filamentos tubulares microscópicos – hifas, que em seu conjunto, formam o micélio.

Material: 3 placas contendo meio de cultura ( Sabouraud, BDA ou ágar Micosel); Tubos com cultura de RhizopusPenicillium e Aspergilus, alça de platina, lâmina, lamínula, azul de metileno, microscópio

Métodos:

  • Inocular uma placa com , outra com e outra com , colocando uma alçada no centro da placa (Não espalhar);RhizopusPenicilliumAspergilus
  • Incubar a temperatura ambiente ou a 28ºC por 48 horas[1]
  • Observar e anotar as características macroscópicas das colônias
  • Com uma alça de platina retirar um fragmento da colônia, colocar sobre uma lâmina, pingar uma gota de corante (azul de metileno, azul de algodão ou verde malaquita, etc., ), cobrir com uma lamínula e observar no microscópio em lente de 40X

 Resultados:  Anotar as características macroscópicas e microscópicas das colônias:

 Características macroscópicas: extensão do crescimento, o tipo de pigmentação dos esporos ou micélio, o tamanho das colônias, etc.

Características microscópicas: tipos de hifas (septadas ou não septadas), presença de esporos, corpo de frutificação (estrutura formadora de esporos) , disposição (desenho), etc.,

TÉCNICA DE MICROCULTIVO PARA FUNGOS

 Objetivos: Observação das características morfológicas das hifas e corpos de frutificação dos fungos, utilizados como critério de identificação

Princípio: O microcultivo se fundamenta na cultura do fungo em pequenos pedaço de meio de cultura, entre lâmina e lamínula, onde o crescimento do fungo se espande e fixa na porção inferior da lamínula, que quando retirada com cuidado mantém as estruturas que formam esporos (corpo de frutificação), intacta, o que facilita melhor identificar as características dos fungos

Material: placa contendo ágar sabouraud, placa de Petri, lâmina, lamínula, chumaço de algodão hidrófilo, papel de embrulho, estilete ou alça de platina estéril, Inoculo de fungo (Rhizopus,  Penicillium e Aspergilus), pipetas, gota de azul de metileno, microscópio.

Métodos:

  • Colocar dentro de uma placa de Petri, uma lâmina, uma lamínula e um chumaço de algodão hidrófilo, acondicionar em papel de embrulho e esterilizar por autoclavação;
  • Com auxílio de um estilete ou alça de platina estéril, cortar o ágar Sabouraud em pedaço quadrados de ±15mm e depositar sobre a lâmina que está dentro da placa;
  • Inocular o fungo (ou material biológico) nos 4 lados do pedaço do ágar e cobrir com a lamínula;
  • Adicionar cerca de 2ml de água estéril ao chumaço de algodão dentro da placa[1] e incubar a placa a 28ºC por 24 a 72 horas
  • Após o crescimento do fungo, retirar cuidadosamente a lamínula e colocar sobre uma gota de azul de metileno depositada no centro de uma lâmina.
  • Observar ao microscópio em lente de 40X

 Resultados: Observar as estruturas que formam os esporos, bem como a disposição das hifas (desenhar e comparar com o manual )

RECOMENDAÇÕES DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLINICA/MEDICINA LABORATORIAL. BOAS PRÁTICAS EM MICROBIOLOGIA CLINICA. SBPC/ML. ED. MANOLE. SÃO PAULO. 2015

O principal o objetivo do laboratório de micologia clínica é o isolamento e a correta identificação dos fungos patogênicos. A coleta adequada, o transporte, o processamento e o cultivo das amostras clinicas são etapas essenciais para que esse objetivo seja alcançado. Os profissionais do laboratório clínicos devem ter conhecimento sobre os critérios de obtenção da amostra a fim de obterem os melhores resultados que correlacionem com a suspeita clínica.

 

Tabela 1 fungo

 

Tabela 1a fungos

 tabela 1c

 

CONSIDERAÇÕES SOBRE BIOSSEGURENÇA

Toda amostra processada em micologia deve ser considerada potencialmente patogênica, devendo ser manipulada em uma cabine de segurança biológica. Para fungos filamentosos observados em crescimento bacteriológicos usuais, as placas devem ser seladas com película Parafilm M para prevenir a contaminação acidental com esporos potencialmente infectantes.

Seleção, Coleta e Transporte de Amostras Para Cultura de Fungos

Amostras cutâneas

Amostras de pele e unhas devem ser obtidas por raspagem e acondicionada em frascos estéreis ou em envelopes adequados para exame micológico, feitos de papel cartonado, maleável com bordos contento abas dobrantes autoadesivas para posterior fechamento do envelope. Para a coleta de amostras cutâneas é feita uma limpeza prévia do sítio de coleta com álcool a 70%, e as áreas ativas e periféricas da lesão devem ser raspadas com auxílio da lamina de um bisturi a fim de serem obtidas escamações. Na suspeita de onicomicose a região ungueal deve ser limpa com álcool 70% e posteriormente raspada nas camadas profundas para obtenção de tecido ungueal invadido por fungos. Amostras de couto cabeludo e cabelos são representativas quando obtidas as partes basais do folículo capilar infectado. Pode ser utilizada uma lâmpada d Wood em quarto escuro (lâmpada ultravioleta de 365 nm) para a localização de áreas potencialmente infectados por dermatófitos que fluorescem na presença da luz ultravioleta. Os fios fluorescentes, distorcidos ou quebradiços devem ser selecionados para cultivo.

Aspirado de medula óssea

Amostras recebidas em seringas heparinizadas devem ser inoculadas diretamente em meios apropriado para coleta de fungo. É indicada a coleta de aspirados de medula óssea em frasco de coleta pediátricos de sistema automatizados de hemocultura, em que a proporção amostra/caldo é ideal.

Aspirado, exsudatos, secreções purulentas

Aspirado, secreções purulentas em geral e exsudados devem ser obtidos por aspiração em seringas e transferidas para frascos estéreis. No laboratório, devem ser examinadas em microscopia direta quanto à presença de grânulos e inoculados em meios de cultura para fungos.

Sangue

Podem ser utilizados métodos automatizados de monitoramento continuo para cultivo de fungos em amostras de sangue (BACTEC – Becton Dickinson, Spark, MA ou Bact/Alert – bioMérieux, Durham, NC) ou ainda sistemas de lise centrifugação (ISOLATOR – Wampole Laboratories – Cranbury, Nj) e métodos manuais (cultivo bifásicos – meio liquido e solido.

Escarro

O escarro deve ser colhido preferencialmente pela manhã, quando a expectoração é produtiva, após a higiene bucal habitual do paciente (escovação dental). A amostra deve ser obtida em frasco estéril.

Fezes

Em geral amostras de fezes não apresentam muita utilidade clínica no diagnóstico laboratorial, entretanto, o crescimento abundante e predominante de leveduras pode ter significado ou é indicativo de ausência de flora fecal normal. A colonização por leveduras é comum tanto em indivíduos saudáveis com em imunocomprometidos. Na suspeita de infecções fúngicas do trato gastrointestinal, indica-se a obtenção de fragmentos de biópsia e tecidos.

Líquidos pleural, peritoneal e sinovial

É indicada a coleta em frascos para cultura para fungos de sistema automatizados (p.ex, Frasco Myco F/Lytic Becton Dickinson) ou sistemas de lise centrifugação (ISOLATOR, Wampole Laboratories). Para outros tipos de coleta, obter amostras em frasco estéril, centrifugar a 2.000 x g por 10 minutos e inocular o sedimento em meios de cultura para fungos.

Liquor

O liquor deve ser centrifugado a 2.000 x g por 10 minutos e o sedimento, ser inoculado nos meios de cultura para fungos. Casos um volume inferior a 2 mL seja recebido no laboratório, inocular diretamente nos meios, sem centrifugação.

Tecido

Tecidos devem ser fragmentados em pequenas porções com bisturi ou triturados com adição de pequenos volumes de solução salina estéril. Na suspeita de infecção por zigomicetos, os tecidos devem ser fragmentados em pequenas porções nunca triturados e homogeneizados uma vez que a trituração destrói as hifas e diminui a viabilidade desse grupo de fungos.

Urina

A amostra indicada para cultura de fungos é a urina de jato médio, salvo outra suspeita ou indicação clínica, devendo ser colhida em frasco estéril. É importante ressaltar que a presença de leveduras na urina pode ser um indicativo da sua disseminação em pacientes imunossuprimidos, o que pode preceder candidemia.

tabela 2 fungos
tabela 2a continuação

Transporte de Amostra para Cultura de Fungos

As amostras devem ser colhidas e transportadas para o laboratório preferencialmente em temperatura ambiente ( 15 a 30º) em até 2 horas após a coleta. Em caso de demora é indicada refrigeração (2 a 8º), entretanto devem sr consultados os critérios de exceção para outros setores do laboratório de microbiologia, uma vez que as amostras clinicas costumas ser compartilhadas entre os departamentos.

Cadastramento da Amostra

Os dados demográficos do paciente e os detalhes referentes à amostra e ao sitio de infecção têm fundamental importância para o diagnostico microbiológico das infecções causadas por fungos. O cadastramento laboratorial dos dados do paciente e da amostra deve conter, no mínimo as seguintes informações:

  • Identificação do paciente, sexo, idade, localização (ambulatorial, internado)
  • Indicação ou suspeita clínica
  • Tipo de amostra clínica, sítio e topografia da coleta
  • Uso atual ou prévio de medicamentos, antimicrobianos e antifúngicos

Critérios de Aceitabilidade

  • Coleta asséptica, em frascos estéreis, a prova de vazamento
  • Entrega no laboratório em prazos estabelecidos (o transporte no tempo apropriado definido para cada amostra é crítico para garantir a sobrevivência e o isolamento de organismo fastidiosos e prevenir o supercrescimento de bactérias).
  • Volumes mínimos de amostra para evitar índices de resultados falso-negativos e aumentar as chances de isolamento de organismo a partir de líquidos estéreis. Caso os volumes recebidos pelo laboratório não sejam adequados para eleger os testes laboratoriais que serão prioritários em tal amostra.
  • Em geral, a obtenção de swabs de feridas abertas não é recomendada para culturas de fungos por carrear micro-organismos da flora saprófita local.
  • Sempre que possível, obter amostras antes do uso de agentes antifúngicos.
  •  Compatibilidade de dados entre a identificação primaria da amostra, a requisição medica que acompanha a amostra e a identificação do laboratório: qualquer discrepância observada na identificação da amostra deve ser cuidadosamente verificada antes do processamento da cultura de fungos para evitar erros na fase pré-analítica que possam comprometer o resultado do exame.

Processamento das Amostras para Exame Microscópico Direto

Uma amostra encaminhada para cultivo em micologia pode ser examinada em microscopia direta quanto à presença de estruturas fúngicas, sendo uma análise complementar e nunca substitutiva à cultura

O exame direto é uma análise primária da amostra que pode fornecer ao médico-assistente informações preliminares que contribuem para o início do tratamento, podendo ajudar na determinação do significado do micro-organismo que virá a ser isolado na cultura

Os métodos de exame microscópico direto de amostras em micologia são:

  • Preparo e clarificação em KOH
  • Pesquisa direta para Cryptococucus
  • Colorações

Processamento das Amostras pra Cultura de Fungos

As amostras para cultivo em micologia devem ser inoculadas em meios combinados que garantam o crescimento de todos os agentes de significado clínico. Há uma variedade de combinações que podem ser usadas e em geral, a escolha do conjunto de meios depende de fatores como o perfil de pacientes e de agentes fungicos mais prevalentes e endêmicos na área, o custo, a disponibilidade e a preferência de cada laboratório. Em todos os casos, alguns fatores devem ser considerados e uma complementariedade entre os meios deve ser garantida da seguinte maneira:

  • Adição de cloranfenicol e/ou gentamicina na formulação dos meios de cultura
  • Incorporar a cilco-hexamida ao meio de cultura para inibir o crescimento de fungos saprófitas de crescimento rápido que possam atrapalhar o surgimento de patógenos importantes e de crescimento mais lento. Sera necessário ao mesmo tempo utilizar meio de cultura sem ciclo-hexamida. Deve ser ressaltado que a cicli-hexamida inibe o crescimento de fungos patogênicas importantes, como Cryptococcus neoformans/gattii, Penicillium marneffei, Aspergillus fumigatus, Scedosporium prolificans, algumas espécies de Candida e zigomicetos.
  • Recomenda-se o uso de um meio de enriquecimento para garantir o crescimento de fungos fastidiosos e dimórficos.

A temperatura para incubação e crescimento dos fungos clinicamente relevantes é de 30º C. Se não for possível disponibilizar uma estufa para incubação a 30ºC, indica-se a incubação dos meios em temperaturas ambiente (aproximadamente a 25%C). Não há nenhuma vantagem adicional em incubar culturas primarias rotineiramente também entre 35 e 37%C, isso deve ser feito apenas em casos específicos em que a suspeita de fungos dimórficos é levantada.

A maioria das culturas deve ser mantida por um período máximo de incubação de 4 semanas, exceto culturas de orofaringe, secreção vaginal e urina ou culturas em meios cromogênios que podem ser liberadas em 48 horas. Para cultivos com suspeita indicativa de fungos dimórficos, recomenda-se incubação estendida para até 8 semanas antes de ser liberado um resultado negativo para crescimento de fungos.

QUESTÕES

PROPRIEDADES GERAIS DOS FUNGO

  1. Dê as características gerais dos fungos.  RESP = Os fungos são encarióticos, diferem, portanto, das bactérias, algas azuis e proclorofíceas. Como já foi mencionado anteriormente, os fungos não possuem clorofila e nesta característica constituem um grupo bastante homogêneo; não há exceções. Excetuando-se os raros casos, possuem paredes celulares definidas, são geralmente imóveis, porém podem possuir estágios reprodutivos móveis, reproduzindo-se assexuadamente através de esporos, na maior parte dos casos. Não possuem caule, raízes ou folhas, nem um sistema de condução sofisticado como as plantas superiores. A forma varia desde um simples talo esférico sem qualquer outro acessório e que se transforma totalmente em um esporângio na maturidade, até a forma filamentosa multicelular (micelial), ramificada ou não. Os núcleos são relativamente fáceis de serem observados e as estruturas somáticas, com raras exceções, demonstram possuir restrita ou nenhuma divisão de trabalho
  2. 2.     Qual a importância médica dos fungos?  RESP= Agentes de processos infecciosos (micoses), Agentes de reações de hipersensibilidade, Agentes de micetismo (Amanita phalloidesA. muscariaRussula emetica, etc), Agentes de micotoxicoses (AspergillusPenicillium, Fusarium, etc)
  3. 3.     Quais as principais doenças que os fungos produzem no homem? RESP MICOSES Superficiais: Piedras, Tinea nigra e Pitiríase versicolor; Cutâneas: dermatofitoses, candidíase superficial, Micoses subcutâneas: esporotricose, cromomicose, rinosporidiose, Micoses sistêmicas: paracoccioidomicose, coccidioidomicose, blastomicose, histoplasmose, criptococose, Micoses oportunistas: candidíase, zigomicose
  4. Cite exemplos de esporos sexuais dos fungos. RESP=Zigósporo, Ascósporo, Basidiósporo, Oósporo
  5. Cite exemplos de esporos assexuais dos fungos. RESP=Artrósporo, Blastósporo, Chlamidosporo, Macroconídios,Microconídios, Esporangiósporo
  6. 6.     Comente sobre a nutrição e crescimento dos fungos.  RESP= Os fungos são aclorofilados e heterotróficos. Possuem pigmentos responsáveis pelas cores variadas que apresentam mas nenhuma capaz de absorver energia para síntese de carbohidratos a patir de CO2. Assim, são heterotróficos, mas se nutrem por obsorção, ao contrário dos animais, por ingestão. Excetuam-se os representantes da classe Nyxomicetes que também se nutrem por ingestão.
  7. Os fungos dependem de água líquida para seu crescimento e desenvolvimento. A maioria também depende do oxigênio para a respiração, sendo, portanto:  RESP  aeróbicos.
  8. 8.     Conforme a nutrição, os fungos são classificados em duas categorias, cite-os e faça um breve comentário. RESP= saprófitas (ou sapróbios) e parasitas. Os saprófitas se alimentam de matéria orgânica animal ou vegetal morta e os parasitas vivem dentro de ou sobre organismos vivos (animais ou vegetais), deles retirando seus alimentos.
  9. Os fungos parasitas, pode-se distinguir 3 níveis de parasitismo, cite-os: RESP= a)    Parasita obrigatório: é aquele que só pode viver sobre um hospedeiro. Ex.: Erysiphe sp. ; b)    Saprófita facultativo : normalmente vive como parasita e deste modo atinge seu maior desenvolvimento. Entretanto, dependendo das circunstâncias pode viver como saprófita. Ex.: Phytophtora infestans (parasita de batata) pode se desenvolver em meio de ágar, em laboratório.; c)   Parasita facultativo: é aquele que geralmente é saprófita, mas pode se tornar parasita. Isto ocorre, por exemplo, com certas espécies da Fusarium que habitam o solo vivendo como saprófitas. Se um hospedeiro vegetal (plântulas, por exemplo) adequado for colocado no solo, o fungo passa a atacá-lo, vivendo agora como parasita.
  10. Os fungos vivem exclusivamente como saprófitas, são chamados saprófitas obrigatórios . São incapazes de infectar plantas ou animais vivos. Cite dois exemplos. RESP= São exemplos destes: Rhizopus ("bolor preto do pão"); Penicillium ("bolor azul").
  11. 11.  Os fungos podem viver ainda em simbiose com outros organismos. Cite exemplos.  RESP= O exemplo mais notável são os líquens, nos quais uma determinada espécie de fungo vive em simbiose com uma alga. Outro exemplo é o da micorriza, onde o fungo vive associado às raízes de plantas superiores. As hifas do fungo funcionam como pelos absorventes, retirando água e sais da solução de solo, transferindo-os às raízes da planta. Esta, por sua vez fornece substâncias elaboradas ao fungo.
  12. Para o desenvolvimento dos fungos, necessitam de carboidratos. Estes são necessários para a construção do corpo do fungo e como fonte de energia. Num fungo típico, 50% do peso seco são representados por Carbono. Quais os principais  carboidratos que os fungos utilizam? RESP= glicose, frutose, maltose. A sacarose é também boa fonte de carbono para algumas espécies. Alguns fungos utilizam proteínas, lipídios e certos ácidos orgânicos como fontes de energia.
  13. 13.  Além do carbono, os fungos necessitam de Nitrogênio. Para conseguí-lo, eles se utilizam de fontes orgânicas ou inorgânicas daquele elemento. Quais as principais fontes orgânicas?  RESP= São as proteínas, peptídios e aminoácidos. Na natureza, os fungos decompõem proteínas, e outras matérias para obterem seu suprimento de Nitrogênio. Muitos fungos, entretanto, obtém o Nitrogênio a partir de fontes inorgânicas, como nitratos e sais de amonia.
  14. 14.  Qual a temperatura ótima para o crescimento dos fungos? RESP= Quanto à temperatura, a maioria dos fungos cresce bem entre 0ºC e 35ºC, mas o ótimo fica na faixa de 20ºC a 30ºC. Podem ocorrer casos extremos de tolerância tanto à altas como baixas temperaturas.
  15. Qual a faixa de pH ideal para o crescimento dos fungos? RESP= Quanto ao pH, os fungos preferem meio ácido para o seu crescimento, ficando o ótimo no redor de 6.
  16. 16.  Qual a relação entre a intensidade de luz e o crescimento dos fungos?  RESP= O fator luz não é importante para o seu desenvolvimento, mas um pouco de luz é essencial para a ocorrência de esporulação em muitas espécies. A luz também toma parte na dispersão dos esporos, sendo que os esporângios de muitos fungos são positivamente fototrópicos e descarregam seus esporos em direção à luz.
  17. 17.  COMPLETE: Tipicamente, o talo de um fungo consiste de filamentos ramificados em todas as direções, sobre ou dentro de substrato que exploram como alimento. Tais filamentos se denominam: _________ RESP= HIFAS (grego: hiphe = tecido, trama). O conjunto de hifas se chama: ________  RESP= MICÉLIO (grego: mykes = fungo).
  18. COMPLETE: Na estrutura dos fungos, cada hifa pode ou não estar interrompido por septos. O micélio que contém septos é chamado: _________- RESP= septado,  e o que não apresenta septos em suas hifas, é dito: ___________  Resp= cenocítico (grego: Koinos = comum; Kytos = cavidade).
  19. O micélio pode ser classificado em dois tipos de acordo com o arranjo das hifas, cite-os: RESP= Prosênquima e pseudoparênquima .
  20. COMPLETE. O micélio do tipo: ____________ RESP=  prosênquima, caracteriza-se por sua aparência distintamente filamentosa, enquanto no : _____________________, RESP=  pseudoparênquima,  a estrutura filamentosa não pode ser reconhecida, isto é, lembra um parênquima.
  21. 21.  Os fungos parasitas emitem hifas especiais por entre as células do hospedeiro ou para dentro delas, sugando-lhes os nutrientes através de uma estrutura denominada: ______________   RESP=  HAUSTÓRIO. (Latim: haustor = o que bebe).
  22. Quais as principais polissacarídeos da parede celular dos fungos? RESP = POLIMEROS: quitina, quitosan, celulose, alfa-glicana, beta-glicana, manana. MONOMEROS: N-acetil-glicosamina, D-Glicossaminas, D-Glicose, D-Manose, O tipo e a quantidade do polissacarídeo varia de uma espécie a outra


[1] Não inverter as placas, como se faz na incubação de bactérias

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