METABOLISMOS
- Metabolismo do ácido pirúvico. Os membros da família Enterobacteriaceae podem metabolizar o ácido pirúvico a ácido fórmico e outros produtos:
- Fermentação do ácido fórmico. O ácido fórmico pode ser convertido a H2 e CO2 pela hidrogenoliase fórmica
HCOOH -> CO2 + H2
- Há dois tipos de fermentação do ácido fórmico:
- Fermentação ácida mista (E. coli, Salmonella, Proteuse outros géneros)
- excreção de etanol
- mistura complexa de ácidos
- á. acético
- á. láctico
- á. succínico
- á. fórmico
- CO2 + H2 (1 : 1)
- Fermentação butanodiol (Enterobacter, Serratia, Erwinia e algumas espécies de Bacillus)
- 2-3-butanodiol
- etanol
- ácidos (pequena quantidade): acético, láctico, succínico e fórmico
- CO2 + H2 (5 : 1)
Classificação
- A família integra 47 géneros e mais de 300 espécies
- Os géneros mais importantes do ponto de vista médico e veterinário
- Escherichia
- Salmonella
- Proteus
- Klebesiella
- Shigella
- Yersinia
- Citrobacxter
- Hafnia
- Serratia
- Proteus
- Providencia
- Enterobacter
- Edwardsiella
Habitat
- As enterobactérias têm uma distribuição ubiquitáriaMuitas das enterobactérias fazem parte da flora normal do tracto digestivo.
- São potencialmente patogénicas
- ou são espécies não patogénicas.
- Algumas espécies de vida livre, ocorrem no solo e na água.
- A contaminação fecal da água é indicada pela presença de Escherichia coli.
- Espécies de Klebsiella (incluindo K. pneumoniae), Enterobacter e Citrobacter têm sido recuperados a partir de legumes.
Modo de infecção e transmissão
- É quase sempre por ingestão
- Os fomitos são especialmente importantes.
- Algumas infecções são endógenas.
Patogenicidade
- As manifestações clínicas e trocas patológicas são parcialmente o resultado da acção das endotoxinas.
- As enterotoxinas de E. coli são importantes nas enfermidades diarreicas.
- Salmonella e Shigella são francamente patogénicas.
- Proteus, Serratia, Klebsiella e Enterobacterna maior parte dos casos são oportunistas
- produzem enfermidade em certas condições
- trauma nos tecidos (mastites)
- feridas debilitantes
- malnutrição.
Escherichia coli
- Faz parte da flora normal do tubo digestivo dos mamíferos e aves, onde assume o estatuto de comensal
- É recuperada a partir de uma grande variedade de infecções em muitas espécies animais
- como agente primário
- como agente secundário
Os jovens animais são particularmente mais susceptíveis, e as infecções urinárias as mais frequentes.
Constituição antigénica
- O “mosaico” antigénico de E. colié definido por uma série de determinantes:
- O – parede celular
- F – fímbrias
- H – flagelar
- K – cápsula
E. coli 0157. Micrografia por transmissão electrónica. O157 refere-se ao tipo de antigénio de E. coli que, neste caso, é basedo na estructura molecular precisa do polissacarídeo O-especifico no LPS da parede celular.
Toxigénese
- EndotoxinasCitotoxinas necrozantes
- provocam fenómenos de hipersensibilidade
- Verotoxinas
- Enterotoxinas
- LT – termolábil
- ST – termoestável
Estirpes enteropatogénicas
- Conhecem-se 6 categorias de E. coli, do ponto de vista patogénico:
- enterotoxigénicas (ETEC)
- enteropatogénicas (EPEC)
- enteroinvasivas (EIEC)
- enterohemorrágicas (EHEC)
- enteroagregativas (EHEC)
- necrotoxigénicas (NTEC)
Factores de virulência de E. coli i solada de infecções fora do intestino
Factor de virulência
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Patogénese
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Plasmídeo col V
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-Codifica para o sideróforo (aerobactina) para a quelação do Fe
-Aumenta a resistência bacteriana ao soro
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Hemolisina
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-Danifica as células do hospedeiro;
-Liberta o Fe dos glóbulos vermelhos
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Enteroquelina
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-quela o Fe para a absorção bacteriana
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Antigénio K1
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-Impede a fagocitose
-Bloqueia a ligação do factor C3b
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P-pili
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-Permitem a ligação às células do tracto urinário, especialmente nos rins
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Pili tipo 1
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- Permitem a ligação (1) ao epitélio da bexiga, (2) aos resíduos de D-manose em várias células
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Estirpes ETEC
- Das seis categorias, é a mais importante causadora de diarreia em vitelos, borregos e leitões
-
- As enterotoxinas juntamente com os antigénios fimbriares são os factores de virulência mais destacáveis identificados em ETEC
- Duas enterotoxinas, uma termostável (ST) e outra termolábil (LT), são produzidas pelas estirpes ETEC, ambas plasmídeodependentes
- a LT estimula a adenilciclase, que converte ATP em AMP-cíclico (AMPc). O AMPc induz a excreção de Cl- e inibe a absorção de Na+ (de modo semelhante à toxina colérica), provocando uma grande perda de fluidos.
- A ST activa a guanilciclase, que converte GTP em GMP –cíclico (GTPc). Induz a excreção de electrólitos e água para o lumen intestinal
- diarreia líquida característica
- As culturas K88 de ETEC estão normalmente associadas com a diarreia primária em suinos eas culturas K99 de ETEC com a diarreia primáriaem vitelos
- A letra K refere-se, normalmente aos antigénios de superfície, designadamente de natureza fímbrica
- A colonização do intestino delgado pelas estirpes enterotoxigénicas de E. coli depende de certas estruturas fímbricas.
Estirpes EPEC
-
- Por definição, são serogrupos reconhecidos como causadores de síndromes diarreicos em humanos
- Nos animais, estas estirpes ligam-se às células epiteliais do intestino e destroem as microvilosidades.
Estirpes EIEC
-
- Podem penetrar no epitélio intestinal, principalmente naquele do Intestino grosso, provocando diarreias líquidas
- Os factores de virulência são de informação cromossómica e plasmídica
Estirpes EHEC
-
- Também são designadas como E. coli verotoxigénicas (VTEC).
- Mais de 57 serótipos isolados no Homem e animais
- Colonizam a mucosa intestinal de uma forma íntima
- Apagam as microvilosidades
- As fímbrias são de informação plasmídica
- Produzem verotoxinas tipo I e II
- também designadas “toxinas shigelóides” tipo I e II
- activas contra células vera e HeLa
- Colonizam o epitélio do intestino e destroem as microvilosidades
- Não são enteroinvasivas
- O sorótipo O157:H7 é o mais importante associado no Homem com
- colite hemorrágica
- sindrome urémico e hemorrágico
- mortes nos Estados Unidos por consumo de hamburgers
- podem estar presentes no tubo digestivo dos bovinos
Estirpes EAEC
-
- Provocam diarreias em humanos
- Nunca foi evidenciada a sua presença como agentes patogénicos em animais domésticos
Estirpes NTEC
-
- Provocam diarreias
- Homem
- Vitelos
- Borregos
- Suinos
- Produzem citotoxinas necrosantes
- CNF1 e CNF2
- NTEC2 – isoladas apenas em vitelos
Doenças causadas por E. coli - colibaciloses
- A designação colibacilose é um termo geral que denota uma infecção por E. coli
- caracterizada por um ou mais dos seguintes sintomas:
- diarreia
- enterite
- septicémia ou bacteriémia
- colibacilosesContrariamente a outras enterobactérias, com a excepção de Yersinia, as Salmonellae são parasitas intracelulares obrigatórios
- colibacilose dos recém-nascidos
- doença dos edemas (suinos)
- diarreia do pós-desmame (suinos)
- As estirpes invasivas
- são fagocitadas pelos macrófagos, e espalhadas pelo sistema linfático, pela corrente sanguínea ou por ambos
- Conhecem-se 3 formas principais de salmoneloseem humanos:
- febres entéricas
- septicémia
- gastroenterite
- As formas observadas em animais são:
- septicémias hiperagudas
- enterites agudas
- enterites subagudas
- enterites crónicas.
Salmonella
- As salmonellae são actualmente agrupadas em uma única espécie
- S. entericasubdivide-se em sete subespécies com base em características bioquímicas diferenciais
- enterica
- salamae
- arizonae
- diarizonae
- houtenae
- indica
- bongori
- A quase totalidade (99,7 %) de Salmonellae isoladas no Homem e animais pertencem à subespécie enterica
- As estirpes das outras subespécies são sobretudo encontradas
- em animais poiquilotérmicos
- no meio ambiente
- só muito excepcionalmente estão implicadas em distúrbios da saúde animal e humana
Doenças provocadas por Salmonella
- Factores de virulência
- É geralmente aceite que a endotoxina (lipopolissacarídeo) de Salmonella contribui fortemente para a patogénese
- Outros factores de virulência estão naturalmente associados e que contribuem para a instalação da doença
- fímbrias de adesão
- produção de colicinas
- enterotoxinas
- citotoxinas
- porinas
- sideróforos
- Salmonelloses
- Salmonella typhi é responsável pela febre tifóide em humanos
- S. dublin provoca infecções severas em vitelos
- S. cholerasuis, provoca enterites em suinos
- S. abortus-bovis, provoca abortos em bovinos
- S. abortus-ovis, provoca abortos em ovinos
- S. gallinarum, provoca infecções intestinais agudas em galinhas e perús
- S. pullorum, provoca severas infecções em pintos
Isolamento e Cultura
- As Enterobactereaceae crescem bem nos meios de cultura ordinários
- Os laboratórios dispoem de meios selectivos que favorecem o crescimento de alguns géneros.
Colheita de material para laboratório
- Tecidos, fezes ou material intestinal são normalmente utilizados para as culturas
- As colónias das várias enterobactérias cultivadas em agár-sangue são muito semelhantes no aspecto, com umas poucas excepções
- As colónias nos meios selectivos, no entanto, mostram consideráveis diferenças entre os géneros.
Identificação
- Depois de observar o tipo e o número de colónias, várias são inoculadas em agar Kligler( sugar iron agar)Estas reacções juntamente com as designadas por IMVIC (indol, metil red, Voges-Proskauer – acetil metil carbinol, utilização de citrato) e outras reacções acessórias, identificam os principais géneros.
- meio utilizado para verificar a fermentação de lactose, glucose e a produção de H2S e gás
- É um meio inclinado que é inoculado primeiro por picada profunda e depois por estria na superfície inclinada e incubado 18 horas a 37 o C
- Obtêm-se as seguintes reacções:
- 1 – Superfície alcalina (vermelho) e fundo ácido (amarelo) – só fermentação da glucose
- 2 – Superfície ácida (amarelo) e fundo ácido (amarelo) – lactose fermentada; glucose fermentada
- 3 – Enegrecimento ao longo da linha de picada ou fundo: produção de H2S
- 4 – Bolhas de gás no agar: algumas enterobactérias fermentativas produzem gás, enquanto muitas outras não
BIBLIOGRAFIA
- CARTER, G. R., M. M. GHENGAPPA and A. W. ROBERTS, 1995. Essentials of Veterinary Microbiology. 5th Edition, Williams & Wilkins.
- COSTA, P. C. D. F. M., 1999. Aspectos da interacção das microfloras cecais com as infecções por Salmonella sp. em frangos. Dissertação de Mestrado. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.
- EUZÉBIE, J. P., 1998. Dictionnaire de BácteriologieVétérinaire. Société de Bácteriologie Systématique et Vétérinaire.]
- PRESCOTT, HARLEY & KLEIN, 2002. Microbiology, 5th edition. McGraw Hill.
- QUINN, P. J., M. E. CARTER, B. MARKEY and G. R. CARTER, 1994. Clinical Veterinary Microbiology. Wolfe.
PRÁTICAS
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ENTEROBACTERIAS -COPROCULTURA
Objetivos: Isolar germes enteropatogênicos de fezes e observar as características morfológicas das colônias dos princiapais germes.
Princípio: A coprocultura fundamenta-se na pesquisa dos enteropatógenos nas fezes, tais como Escherichia coli, Salmonella, Shigella, outras Enterobacterias e Enterococos.
A pesquisa de outros enteropatógenos tais como Campylobacter, Vibrio cholerae, são realizados em meios de cultura especiais, devendo ser solicitada pelo médico
Material: Amostra de fezes[1], ágar verde-brilhante ( Kristensen), ágar EMB, ágar SS e caldo selenito ou tetrationato, alça de platina, bico de Bunsen, estufa a 37ºC.
Metodologia:
- Semear as fezes pelo método de esgotamento, nos seguintes meios de cultura: ágar verde-brilhante (Kristensen) , ágar EMB, ágar SS e ágar-sangue.
- Incubar os meios a 37ºC por 24 a 48 horas.
- Observar as características da colônias e proceder a identificação (provas bioquímicas)
- A semeadura deve ser feita com alça de platina ou bastão em L (espátula de Drigalsk), em três setores de cada placa, de maneira a esgotar progressivamente o inóculo, com vistas à obtenção de colônias isoladas.
- Semear primeiro os meios de ágar verde-brilhante (Kristensen) e ágar SS e, sem recarregar a alça, passar para o meio EMB ou Mac Conkey.
- Para o enriquecimento, semear um fragmento de fezes mais ou menos do tamanho de uma ervilha (ou, em se tratando de fezes líquidas ou de suspensão em meio de transporte, cerca de 1 a 2 ml) em tubos de caldo selenito.
- Incubar a 37ºC e após 18-24 horas, transportar para os meios de isolamento (Kristensen, SS e EMB).
Resultados:
No meio de Kristensen (ágar verde brilhante), as colônias de salmonella são róseas, transparentes e circulares; os Proteus são inibidos e crescem apenas na variante “O”, formando colônias róseas circunscritas; os coliformes são inibidos substancialmente, porém os que se desenvolvem produzem colônias opacas e amarelas. Quanto às Shigellas, não se desenvolvem no meio de Kristensen.
Em ágar SS, crescem bem tanto as Salmonellas quanto as Shigellas, sob a forma de colônias circulares, incolores e transparentes; os Proteus dão colônias “O” que só se distinguem das colônias deSalmonella por serem um pouco maiores e menos transparentes e os coliformes são inibidos ou formam colônias vermelhas.
Em ágar EMB, as Salmonellas e Shigellas crescem sob a forma de colônias róseas, transparentes, ao passo que os coliformes produzem colônias negras (Escherichia coli) ou colônias mucóides róseas, com centro negro (Enterobacter); os Proteus são inibidos e tendem a formar um véu invasor.
IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA - ENTEROBACTERIACEAE
Objetivos: Realizar provas bioquímicas para identificar as bactérias da familia Enterobacteriaceae
Princípio: As bactéria são identificadas por características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e sorológicas. As provas bioquímicas se baseiam no metabolismo bacteriano, onde se observa a produção ou degradação de metabólitos, que reagem no meio de identificação produzindo cores características para cada prova.
Material: Placas com colônias isoladas de bactérias Gram-negativas, meios de identificação (EPM, MILI e CIT), alça de platina.
Método: Com as placas contendo colônias isoladas de bactérias Gram-negativas, observar as características das colônias, “pescar” a colônia suspeita, e semear nos seguintes meios de identificação presuntória: EPM[2], MILI e CIT. Para inocular o meio EPM, introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio. A inoculação do MILI deve ser feita por picada central, introduzindo a agulha até o fundo do tubo. Incubar a 37ºC por 18-24horas. Fazer a leitura das seguintes provas bioquímicas:
EPM
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MILI
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CIT
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Fermentação da glicose
Produção de gás
Produção de H2S
Hidrólise da uréia
Desaminação do Triptófano
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Motilidade
Produção de Indol *
Descarboxilação da lisina
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Metabolização do citrato
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(*) Adicionar uma gota do reativo de Kovacs e verificar o aparecimento da cor velmelha em forma de anel na superfície do meio
Interpretação: Averiguar as características bioquímicas e procurar na tabela em anexo o germe que mais se assemelha às características
MEIO EPM
- Fermentação da glicose: cor amarela
- Produção de gás: formação de bolhas ou deslocamento do meio do fundo do tubo
- Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade
- Hidrólise da uréia: Aparecimento da cor azul ou verde-azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não
- Desaminação do Triptofano: aparecimento de cor verde-garrafa no superfície do meio. Quando a reação é negativa, a superfície do meio adquire cor azul ou, raramente, amarela
MEIO MILI
- : a bactéria móvel cresce além da picada turvando parcial ou totalmente o meio. A bactéria imóvel cresce somente na picada.Motilidade
- Descarboxilação da Lisina: quando a lisina é descarboxilada, o meio adquire cor púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarela nítida nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio não estiver amarelo
- Produção de indol: após a leitura dos testes de motilidade e lisina, adicionar 3 a 4 gotas de reativo de Kovacs a superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não o produz, o reativo mantém a sua cor inalterada
CITRATO: a utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio não sofrer alteração
Características dos germes da familia Enterobacteriaceae nos meio EPM-MILI-CIT.
EPM
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MILI
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CIT
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GERMES
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Base amarela e superfície azul. Ausência de bolha de gás e de enegrecimento: Gás (-); Gli (+), H2S(-), Urease (-), Trip (-)
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Cor amarela, crescimento somente na picada; indol +/-
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Verde (-)
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Shigella (dysenteriae, flexneri e boydii)
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Base amarela e superfície azul. Ausência de bolhas de gás e de enegrecimento: Gli (+),Gás (-), H2S(-), Urease (-), Trip (-)
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Cor amarela, crescimento somente na picada; indol negativo
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Verde (-)
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Shigella sonnei
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Base amarela e superfície azul com ou sem bolhas de gás. Ausência de enegrecimento: Gli (+),Gás (+/-), H2S(-), Urease (-), Trip (-)
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Cor amarela, crescimento somente na picada; indol positivo
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Verde (-)
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Escherichia coli invasora
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Base amarela e superfície azul, geralmente com bolhas de gás. Ausência de enegrecimento: Gli (+),Gás (+/-), H2S(-), Urease (-), Trip (-)
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Cor púrpura, turvação parcial ou total; indol –positivo
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Verde (-)
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Escherichia coli clássica enterotoxigênica e outras
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Base amarela e superfície azul. Presença de bolhas de gás e de enegrecimento: Gli (+), Gás (+), H2S(+), Urease (-), Trip (-)
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Cor púrpura, turvação parcial ou total; indol – negativo
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Verde (-)
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Salmonella
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Meio azul na base e na superfície. Ausência de bolhas de gás e de enegrecimento: Gli (-), Gás (-), H2S(-), Urease (+), Trip (-)
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Cor amarela, crescimento somente na picada; indol negativo (as vezes positivo).
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Verde (-)
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Yersinia enterocolítica
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[1] Dar preferência às fezes com muco, pus e sangue. Recomenda-se o uso de uma solução glicerinada tamponada, como meio preservador para o preparo de uma suspensão de fezes, a qual deve ser de uma evacuação recente.
[2] Meio de Rugai, modificado por alunos da Escola Paulista de Medicina
QUESTÕES