Prof.Dr.Luis Carlos Figueira de Carvalho

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CARACTERIZAÇÃO BIOQUIMICA

CARACTERIZAÇÃO BIOQUIMICA

PROVAS BIOQUÍMICAS – MÉTODOS CONVENCIONAIS

CARBOIDRATOS (MEIOS PARA FERMENTADORES)

 Meio Básico

  • Peptona ..................... 10g
  • Extrato de carne .......... 3g
  • NaCl ............................. 5g
  • Indicador de Andrade ... 10ml
  • Água destilada ..........  1000ml

 

MODO DE PREPARO: Distribuir em volumes de 3ml em tubos 13 x 100mm, incluindo tubos de Durham, quando indicados. Esterilizar a120°C, por 15 minutos

 A concentração dos carboidratos varia de 0,5 a 1,0%. Glicose, manitol, salicina, adonitol e inositol podem ser acrescentados antes da esterilização. O tempo de esterilização para o glicerol  limita-se a 10 minutos. Dissacarídeos (lactose, sacarose, celobiose) e Carboidratos como arabinose, xilose e ramnose devem ser esterilizados por filtração ou esterilizados separadamente em soluções concentradas a 10% em água, a fim de evitar hidrólise ou caramelização, juntando-se após, assepticamente, aos tubos com o meio básico (0,3ml por tubos).

INDICADOR DE ANDRADE

Água destilada ............ 100ml

Fucsina ácida ..............  0,5g

NaOH 1N .................... 16 ml

Dissolver a fucsina em água e acrescentar o hidróxido de sódio. Se depois de várias horas a fucsina não estiver dissolvida, acrescentar 1 ou 2ml de hidróxido de sódio.

 

Carboidratos

Metabolismo fermentativo x oxidativo (Meio de Hugh & Leifson. 1953)

OF Basal medium (Difco)

9,4 g

Água destilada

1000ml

Distribuir em frascos volumes de 100ml e esterilizar a 120°C, por 15 minutos. Esterilizar soluções de carboidratos na concentração de 10% em água. Os monossacaridios (glicose, xilose, levulose) ou alcoóis (manitol) podem ser esterilizados em autoclave. Os dissacarideos (maltose, lactose, sacarose) devem ser esterilizados por filtração. Juntar 10ml de cada solução para 100ml do meio, de modo a atingir a concentração de 1%. Distribuir em tubos de 13 x 100mm  volumes de 3ml.

Semeiam-se 2 tubos. Em um deles o meio é coberto com camada de óleo mineral (vaselina líquida) de, pelo menos, 0,5cm de altura. O outro é deixado descoberto.

Assim são definidas as seguintes reações:

  • a) acidificação (viragem para amarelo) no tubo coberto com vaselina, bem como no tubo descoberto: fermentação.
  • b) acidificação próxima ou a partir da superficie do tubo descoberto e não-acidificação do tubo coberto: oxidação não-fermentativa.
  • c) ambos os tubos neutros ou tendentes a alcalino: assacarolíticos

Os tipos de metabolismo de carboidratos assim definidos (fermentativo, oxidativo, inativo) estendem-se aos outros carboidratos em definição.

Descarboxilases  (Lisina,  Ornitina   e   Arginina  Descarboxilases)

“Descarboxylase Base Moeller” (Difco) ....... 10,5g

Água destilada ............................................. 1000ml

 Distribuir em frascos de l00ml. Juntar 1,0g dos L-aminoácidos desejados (lisina, arginina, ornitina); ou 2,0g dos DL-aminoácidos correspondentes. Normalmente a adição de ornitina pode exigir um ajuste do pH (6,0) com hidróxido de sódio, pela sua maior acidez.

Distribuir 4ml em tubos 13 x 100mm de tampa de rosca, ou juntar óleo de vaselina em tubos embuchados com algodão. Usar como controle tubos com o meio básico sem adição de aminoácidos. Autoclavar a 120°C, 10 minutos.

O teste positivo é indicado pelo desenvolvimento de comparação acentuadamente púrpura nos tubos com aminoácidos, em comparação com os tubos-controle, em média 48 horas após a inoculação.

 Fenilalanina Desaminase

Meio básico

“Phenylalanine Ágar” ... 23g

Água destilada ............. 1000ml

Fundir; distribuir em tubos 13 x 100mm e esterilizar a 120°C, 10 minutos. Deixar solidificar com os tubos em longa superfície de inclinação.

Inocular com alça e, após crescimento, cobrir a superfície do ágar com solução de cloreto férrico a 10%. O teste positivo revela-se por coloração verde que progressivamente penetra a camada de ágar.

 Produção de Gás Sulfídrico- H2S 

“SIM medium[1]”  ................. 36g

Água destilada ................... 1000ml

Fundir e distribuir volumes de 3 a 4ml em tubos 13 x l00mm. Inocular por picada.

A detecção de gás sulfídrico torna-se mais sensível se empregadas tiras de papel de filtro impregnadas com acetato de chumbo, presas pela bucha ou rolha do tubo, acima do meio, que serve ainda para a detecção de mobilidade. Isto pode ser eventualmente útil na identificação de enterobactérias Morganella e Citrobacter diversus. Não é adequado aos Gram-negativos não-fermentadores.

Para o preparo dessas tiras, corta-se o papel nas dimensões de aproximadamente 0,5 x 5cm. Umedecer com solução aquosa saturada de acetato de chumbo. Deixar secar.

 Produção de Indol

 Meio-base

  • a) “SIM medium” (BBL, Difco)
  • b) “Trypticase Soy Broth”

Reagente - Tiras de papel de Braun-Silberstein

  • p-dimetil-amino-benzaldeído ...... 5g
  • Álcool metílico ............................ 50ml
  • Ácido fosfórico (orto) .................. 10ml

Cortar tiras de papel de filtro grosso de aproximadamente 0,5 x 5,0cm e umedecer no reativo. Deixar secar por 2 a 3 dias ao abrigo de poeira. Prender as tiras de papel à bucha ou rolha dos tubos com os meios citados, durante a incubação. A produção de indol faz o papel virar de amarelo a róseo ou vermelho. O aquecimento dos meios após 48 horas de incubação (em ebulição) eleva a sensibilidade do método, que equivale aos de Kovacs ou Ehrlich, não sendo porém prejudicado pela eventual produção de pigmentos nos meios citados, como ocorre com Pseudomonas fluorescentes. De fato, a pioverdina dá coloração vermelha em meio ácido.

Oxidase (Indofenol oxidase)

Teste de Gady & Hadley, modificado por Ewing & Jonhson, para diferenciação de Enterobacteriaceae e Vibrionaceae (Edwards & Ewing, 1972).

 Meio-base:Tubos de ágar simples ou ágar nutritivo inclinados com cultura de 24 horas em superfície.

Reagentes

a) alfa-naftol

álcool etílico comercial (95%)

1g

100ml

b) cloridrato (ou oxalato) de p-amino-dimetil-anilina. Como descrito no teste de Kovacs, modificado.

 Cobrir o crescimento em ágar com 2 a 3 gotas de cada reagente. O aparecimento de cor azul no crescimento, em dois minutos, indica reação positiva.

 Oxidase (Teste de Kovacs, modificação) - (Teste rápido)

Oxalato de p-amino-dimetil-anilina

Água destilada

1g

100ml

 Conserva-se por volta de duas semanas, ao abrigo da luz, em geladeira.

Em quadrados de papel de filtro, espalha-se com alça de platina ou vidro uma massa de crescimento bacteriano. Sobre esta pinga-se o reativo. Desenvolve-se cor vermelha que se intensifica em segundos. Alças de níquel-cromo e outros metais que se oxidam darão reações, falso-positivas se deixarem resíduos no papel de filtro.

 TESTE VP (Voges-Proskauer)  e VM (Vermelho-de-Metila)

 O meio básico é produzido por vários fabricantes. Obedece a fórmula abaixo:

Peptona ...................................... 7,0g

Fosfato dibásico de Potássio ...... 5,0g

Glicose ..................................... 5,0g

Água destilada ....................... 1000ml

PH ± 6,9. Distribuir volumes de 3ml em tubos 13 x 100mm. Esterilizar a 115°C, por 15 minutos ou a 120°C por10 minutos. O meio deve mostrar-se quase incolor.

 Após inoculado, incubar a 37°C, por 48 horas, ou à temperatura ambiente (+ 30°C), por 96 horas. O nóculo abundante e a temperatura mais baixa favorecem a positividade do teste, particularmente para Hafnia e Proteus mirabilis.

Para leitura, juntar para cada mililitro de cultura o reativo de Barritt:

Solução de alta-naftol a 5% em álcool absoluto ........ 0,6ml

Solução aquosa de KOH a 40% ............................... 0,2ml

 Como alternativa mais conveniente para rotina, juntar para cada mililitro de meio partes iguais ( + 0,5ml) de:

Solução de alfa-naftol a 6% em álcool absoluto ............... 0,5 ml

 

Solução aquosa de KOH a 16% ....................................... 0,5ml

 

Agitar bem e observar o desenvolvimento de coloração de rosa a vinho, intensa, em 15 minutos. Coloração parda deve ser desprezada.

 Reação do VM:

A 5cm3 da cultura em meio básico adicionar 5 gotas de uma solução hidroalcoólica de vermelho-de-metila.

Solução de Vermelho-de-Metila

Vermelho-de-metila  .............. 0,1 ml

Álcool-de-metila .................. 300 ml

Água destilada ..................... 500 ml



[1] Os meios comerciais “TSI” e “Kligler” são também adequados.

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