Prof.Dr.Luis Carlos Figueira de Carvalho

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Biologia Molecular

Biologia Molecular

RECOMENDAÇÕES DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLINICA/MEDICINA LABORATORIAL. BOAS PRÁTICAS EM MICROBIOLOGIA CLINICA. SBPC/ML. ED. MANOLE. SÃO PAULO. 2014

 

Os cincos exames de biologia molecular de maior volume nos laboratórios clínicos são aqueles que detectam agentes de doenças infecciosas: HPV, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, HIV, HCV e HBV. Em função da tendência de centralização de métodos na maioria dos laboratórios, esses testes usualmente são alocados em um setor exclusivo de testes moleculares, e não no setor de microbiologia. Há, no entanto, testes que necessitam de uma interação mais estreita entre os setores de microbiologia e biologia molecular: identificação microbiana por sequenciamento de DNA e detecção de genes de resistência aos antimicrobianos.

 

IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA POR SEQUENCIAMENTO DE DNA

 Não há um gene único que possa ser utilizado para a diferenciação de todas as espécies bacterianas conhecidas. No entanto, o alvo mais utilizado é o gene rrs, também designado como rRNA16S. Por ser um alvo presente em todas as bactérias conhecidas, é o mais  utilizado na rotina de microbiologia.

  Há duas abordagens possíveis. A primeira, mais comumente utilizada, é a identificação de espécies bacterianas cuja caracterização por métodos fenotípicos não tenha sido possível, enquanto a outra consiste em detectar a caracterizar patógenos em sítios estéreis.

  Para a identificação de espécies a partir de culturas, o ideal é que sejam empregadas culturas puras e recentes. Apesar de haver disponibilidade de programas para a análise de sequências obtidas a partir de culturas mistas, isso dificulta a análise e, por vezes, permite apenas identificação no nível de espécie.

   Outro aspecto é o fato de que para a análise dos resultados há necessidade de utilização de programa específico, disponível comercialmente, como o RipSeq. Para amostras contendo duas espécies, na maioria da vezes, é possível a identificação das espécies, mas nas amostras com três ou mais espécies bacterianas a identificação limita-se ao gênero na maior parte dos casos.

  Abordagem de menor custo e que não necessita de software exclusivo é o uso de culturas puras. O primeiro passo, na fase pré-analítica, é, portanto, extrair DNA de cultura pura e jovem. Culturas com maior tempo de incubação podem resultar em baixa quantidade de DNA extraído. Um bom exemplo são as espécies de gênero Bacillus, que são esporuladas. Quanto mais velha a cultura, proporcionalmente maior é a quantidade de esporos e mais difícil a obtenção de DNA.

   Para a maioria dos gêneros bacterianos, basta a extração por lise térmica, mediante preparo de suspensão bacteriana com turbidez equivalente ao padrão 1 da escala de McFarland em água livre de DNAse e RNase e fervura por 10 minutos.

  Para a amplificação do gene rrs, que tem cerca de 1.500 pares de bases, podem ser utilizados diferentes pares de iniciadores que anelam em regiões conservadas desse gene, e que flanqueiam regiões ditas hipervariáveis.

  Uma vez obtidos os eletroferogramas, é necessário avaliar se há picos duplos e se estão presentes em toda a sequência ou em apenas uma a três bases. Como na maioria das espécies bacterianas há múltiplas cópias desse gene no mesmo cromossomo, é possível a ocorrência de variações de sequências na mesma cepa bacteriana. No caso de eletroferogramas com múltiplos picos duplos a pureza da cultura deve ser reavaliada e todo o processo precisa ser reiniciado.

   O programa comercialmente disponível MicroSeq contém uma base de dados depurada, realiza a montagem da sequência consenso e libera um laudo final. É uma solução segura e de ótima qualidade para identificação bacteriana, mas, quando se lida com espécies raras, a análise pode ser inconclusiva.

   Caso não seja utilizado o programa MicroSeq, diversos programas podem ser usados para obtenção da sequência consenso a partir dos eletroferogramas, a exemplo de CLCBio, DNABaser e DNAStar. Essa sequência consenso deve ser comparada com aquelas disponíveis no GenBank, utilizando-se o programa BLAST. Na opção data base, selecionar a opção “Other”. Na opção “exclude”, selecionar, pois do contrario a análise será mais trabalhosa e os resultados incluirão sequências de metagenoma. O próximo passo é verificar quais gêneros e espécies tem maior similaridade com a sequência que está sendo analisada. Para alguns laboratórios, a análise termina liberando-se o resultado referente ao depósito de maior similaridade com a sequência analisada; entretanto, recomendam-se alguns passos adicionais importantes. Após verificar qual é o gênero bacteriano, deve-se consultar o documento MM18 do CLSI, que detalha em quais gêneros o gene rrs (Rrna16S) pode ser utilizado para a diferenciação entre Bacillus subtilis e Bacillus anthracis, avaliando fragmentos de 500 ou 1.000 pares de bases do rrs. Esse documento também indica quais genes devem ser parcialmente sequenciados para a diferenciação entre as espécies.

  Uma vez que seja possível a diferenciação entre as espécies utilizando-se o gene rrs, o próximo passo deve ser consultar, na base de dados LPSN, qual a cepa padrão da espécie com maior similaridade obtida com o BLAST. Esse site contem as designações da cepa padrão de cada espécie nas diferentes coleções de culturas e também o código de acesso do depósito referente ao gene rrs, da cepa padrão no GenBank. O índice de similaridade a ser reportado no  resultado deve ser sempre em relação à cepa padrão da espécie. Essa abordagem evita variabilidade entre resultados liberados. A definição da espécie bacteriana é objeto de constante debate. O critério mais seguro para a identificação da espécie é um índice mínimo de 99,5% de similaridade entre a sequência analisada e aquela da cepa padrão da espécie desde que seja analisado um fragmento com um mínimo de 1.00 nucleotídeos. Índices de similaridade entre 95 a 99,4% devem ser liberados apenas como identificação conclusiva do gênero bacteriano. Índices de similaridade inferiores a 95% usualmente indicam novo gênero bacteriano. Esse achado deve ser confirmado com o sequenciamento de outros genes e avaliação de características fenotípicas da cepa analisada.

   A despeito dos procedimentos de controle de qualidade e de processos no setor de biologia molecular, é recomendável que a liberação final do resultado seja feita pelo setor de microbiologia. Nessa fase pós-analítica, deve ser feita a avaliação da consistência entre o resultado do sequenciamento e as características fenotípicas da cepa analisada. Características mínimas, como morfologia ao método de Gram, oxidase e catalase são de execução simples e acrescentam confiabilidade ao resultado. Finalmente, o resultado deve estar de acordo com a nomenclatura oficial dos procariotos. Apenas os nomes científicos vigentes devem ser utilizados; portanto, antes de liberar a identificação, deve ser feita consulta à página do listo f Prokaryotic Names with Standing in the nomenclature. Opcionalmente, visando a facilitar a compreensão do laudo pelo clínico ou a compreensão da epidemiologia, a nomenclatura antiga pode ser colocada entre parênteses ao lado do nome atual. Um exemplo marcante é Mycobacterium massiliense, espécie que causou surtos de infecções de sítio cirúrgico em diversos estados do brasil e atualmente é denominada Mycobacterium abscessos ssp bolletii.

 

DETECÇÃO DE GENES DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA

A detecção de genes que codificam resistência a antimicrobianos pode ser realizada diretamente de amostras clínicas, como swab nasal, swab retal, sangue ou hemoculturas positivas ou ainda diretamente de culturas puras. Nos  sistemas comercialmente disponíveis, a exemplo da detecção do gene mecA, as reações já incluem um controle interno. Alguns laboratórios têm desenvolvido testes in house ou simplesmente têm reproduzido métodos descritos em publicações científicas, a exemplo da reação em cadeia da polimerase para genes que codificam carbapenemases, visando à detecção de genes bla. Além de elevadas especificidade e da sensibilidade, toda reação que visa à detecção de um alvo gênico deve possuir controle interno. Se o alvo é DNA bacteriano, o controle interno que pode ser utilizado tanto em amostras clínicas como para a análise de cepas bacterianas é o rDNA 16S. Idealmente, o produto amplificado do controle interno deve ter tamanho maior do que aqueles dos alvos do teste, de moto a não haver competição. O uso do controle interno garante que não houve inibição da DNNA polimerase na PCR.

  Outro aspecto importante se refere a como liberar o laudo. É essencial que, nos testes para detecção de genes que codificam betalactamases, conste no laudo quase variantes são detectadas como os iniciadores e sondas utilizados, pois nas betalactamases há uma constante descrição de novas variantes.

  Da mesma maneira que na identificação de espécies, é recomendável que o resultado da detecção de genes de resistência em cepas bacterianas deva ser liberado pelo setor de microbiologia, de modo a confrontar os resultados. A positividade do teste fenotípico e a negatividade do teste molecular pode indicar tratar-se de um novo gene ainda não descrito ou uma nova variante alélica também ainda não descrita, com variação da sequência nucleotídica na região de anelamento dos iniciadores.

 

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